Wyraźne populacje progenitorowe w mięśniach szkieletowych są pochodnymi szpiku kostnego i wykazują różne losy komórek podczas regeneracji naczyń czesc 4

Pierwszorzędowy Ab przeciwko. -Gal (Cortex Biochem, San Leandro, Kalifornia, USA, 1: 500) i anty-królicze Alexa 488 lub 594 drugorzędowe Abs zastosowano do kolokalizacji ekspresji LacZ w komórkach naczyniowych. Nakładki zostały zamontowane przy użyciu Vectashield zawierającego barwnik jądrowy DAPI (Vector Laboratories), a szkiełka były oglądane przy użyciu epifluorescencyjnego mikroskopu Zeiss wyposażonego w różnicową kontrastową kontrastową interferencję. Jako kontrole, sekcje mięśni szkieletowych z C57Bl / 6 i FVB / N-TgN (Tie-2LacZ) były podobnie wybarwione immunologicznie. Cytryny komórek SP i SP spoza mięśni także utrwalono 4% paraformaldehydem i barwiono immunologicznie, jak wyszczególniono powyżej, stosując pierwszorzędowe Abs wobec desminy (DAKO A / S, 1: 500), kalponinę (Sigma-Aldrich; : 5000), SM-P-aktynę (DAKO A / S, 1: 500), Flt-1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA, 1: 200) i PDGFR-. (PharMingen, 1: 250). Wyniki Mięśnie szkieletowe zawierają dwie populacje progenitorów naczyniowych. Wyizolowano komórki mięśni szkieletowych (Figura 1a), wybarwiono barwnikiem Hoechst 33342 i poddano FACS, uzyskując charakterystyczną populację SP, w zakresie od 0,1% do 0,5%, i populację spoza SP, w zakresie od 70% do 85% żywotne komórki (Figura 1b). Pochodzące z mięśni populacje SP i nie-SP były fenotypowo różne (ryc. 1c): komórki SP były stale okrągłe, nieprzylegające i miały jednakową wielkość; mając na uwadze, że populacja spoza SP zawiera głównie adherentne komórki w kształcie wrzeciona. Ekspresję genów odzwierciedlających progresywne etapy zaangażowania i różnicowania linii komórek naczyniowych analizowano w frakcjonowanych w Percoll komórkach mięśniowych, a także frakcjach mięśniowych SP i nie-SP, stosując analizę RT-PCR. Frakcjonowane w Percoll komórki mięśniowe eksprymowały markery zarówno linii komórkowej śródbłonka (VE-cad, ICAM-2, Flt-1, Flk-1), jak i linii mięśni gładkich (SM – y – aktyna, kalponina) (Figura 2a). Wysoce oczyszczone komórki SP mięśni szkieletowych, przeciwnie, nie miały markerów komórek śródbłonka, mięśni gładkich lub mezenchymalnych i były ujemne pod względem CD34 (Figura 2b). Mięsne komórki spoza SP wyrażały SM-a-aktynę mRNA, charakterystyczną dla progenitorów mięśni gładkich, lub komórek mezenchymalnych (15), jak również wykrywalne poziomy CD34 i czasami kalponiny, ale nie eksprymowały mRNA desminy. Co ciekawe, obie populacje pochodzące z mięśni eksprymowały gen receptora czynnika wzrostu hepatocytów / scatter factor, c-met (Figura 2, a (cc), który jest również wyrażany przez komórki progenitorowe mięśni szkieletowych, komórki satelitarne, zawarte w mięśniu szkieletowym (16). ). Figura 2 Analiza ekspresji genów specyficznych dla naczyń krwionośnych w komórkach pochodzących z mięśni szkieletowych. Przeprowadzono analizę RT-PCR całkowitego RNA (50 ng / próbkę) wyizolowanego z różnych populacji komórek mięśnia szkieletowego: (a) frakcjonowanych pod mikroskopem komórek mięśni szkieletowych; (b) populacja SP mięśni; oraz (c) populacja mięśni spoza populacji SP. (d) Komórki SP pochodzące z szpiku kostnego bezpośrednio porównano z komórkami SP pochodzącymi z mięśni szkieletowych. GAPDH został użyty jako kontrola obciążenia. Analizy przy użyciu każdego zestawu starterów przeprowadzono na trzech do pięciu niezależnych izolatów RNA z każdej populacji komórek; reprezentatywne dane są pokazane. Amplikon wytworzony z każdego zestawu starterów został sklonowany i zsekwencjonowany w celu sprawdzenia, czy startery amplifikują zamierzony gen. VE-cad, VE-cadherin; SM A, SM-P-aktyna; m, marker; B, szpik kostny SP; M, mięśnie SP. Gdy równolegle analizowano komórki szpiku pochodzące od szpiku i mięśni, widoczne były wyraźne różnice w ekspresji molekularnej (Figura 2d). Komórki SP szpiku kostnego eksprymowały geny odzwierciedlające embrionalne hematopoetyczne progenitory (17) i progenitory naczyniowe (17, 18, 19), w tym PE-CAM-1 i Tal-1, a także VEGF-A. Komórki SP mięśniowe nie miały jednak ekspresji Tal-1 i VEGF-A (Figura 2d). Zgodnie z oczekiwaniami obie populacje komórek SP nie wykazywały ekspresji genów odzwierciedlających linie komórkowe śródbłonka (Flk-1, Flt-1, VE-cad, Tie-1) lub mięśni gładkich (SM – y – aktyna, kalponina, Ang-2). Analizę FACS przeprowadzono równolegle z RT-PCR w celu zbadania ekspresji następujących białek powierzchniowych komórki: CD45 (Figura 3a), Tie-2 (Figura 3b), Sca-1 (Figura 3c) i PE-CAM-1 ( Figura 3d), jak również CD34, Flk-1 i VE-kadheryna (nie pokazano). Przeciwciało anty-CD45 oznaczało wysoki odsetek zarówno komórek SP (63,6%. 17,7%), jak i spoza SP (92,9%. 2,8%). Sca-1 był również wyrażany w obu populacjach (SP, 44,7%. 13,7% i nie-SP, 26,8%. 18,5%), chociaż ekspresja w populacji spoza SP była wysoce zmienna. Populacja SP wykazywała wyższy odsetek komórek Tie-2-pozytywnych niż komórki niebędące SP, 38,7%. 2,5% i 9,5%. 1,1%, odpowiednio, i wyższy odsetek komórek wyrażających PE-CAM-1 (3, 19,8%. 8,0% i 4,6%. 3,5%, odpowiednio
[podobne: jak oduczyć psa skakania, refluks u dziecka objawy, linka treningowa dla psa ]
[podobne: jak oduczyć psa skakania, flucontrol max, bioxetin opinie ]