Wyraźne populacje progenitorowe w mięśniach szkieletowych są pochodnymi szpiku kostnego i wykazują różne losy komórek podczas regeneracji naczyń cd

Primary Ab (wszystkie z PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) obejmowały: CD45 (klon 30-F11), CD34 (klon 49E8), Sca-1 (E13-161.7), Flk-1 (klon Avas 12. ), ICAM-2 (klon 3C4), PE-CAM-1 (klon MEC 13.3) i VE-kadheryna (klon 11D4.1), skoniugowane z PE lub FITC, lub następnie barwione sprzężonym z PE lub FITC wtórne Ab (s. Laboratories, Burlingame, California, PharMingen). Ekspresję białka Tie-2 badano za pomocą fluoresceiny-di-a-D-galaktopiranozydu (FDG) (zestaw cytometrii przepływowej FluoReporter LacZ, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon USA), ładując, za pomocą wstrząsu hipotonicznego, mięśnie szkieletowe SP i komórki spoza SP wyizolowane z FVB / N-TgN (Tie-2LacZ), które eksprymują LacZ pod kontrolą promotora Tie-2 (13). Komórki zawierające FDG poddano FACS w celu określenia poziomów aktywności p-galu, o czym świadczy wytwarzanie produktu rozszczepienia fluorescencyjnego, który bezpośrednio odzwierciedla ekspresję LacZ napędzaną przez transkrypcyjną aktywację Tie-2 w komórkach SP i niebędących SP. Specyficzne dla gatunku drugorzędowe Ab (anty-szczurze PE lub FITC) i dopasowany pod względem izotypów Ab (mysi anty-szczurzy IgG2b ., PharMingen klon G15-337 i mysi anty-szczurzy IgG2a ., PharMingen klon R35-95) zostały użyte jako kontrole negatywne do bramkowania i analizy cytometrii przepływowej. Wszystkie analizy przeprowadzono na czterech niezależnych izolacjach komórek przy użyciu potrójnego lasera MoFlow Instrument (Cytomation Inc.), jak opisano (4). Wygenerowane dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (oprogramowanie Treestar) i przedstawiono jako średnią. SD czterech niezależnych eksperymentów. Określenie pochodzenia progenitorów naczyniowych w mięśniach szkieletowych. Naszym celem było ustalenie, czy komórki SP i nie-SP rezydujące w mięśniu szkieletowym pochodziły z komórek macierzystych szpiku kostnego. W tym celu komórki SP pochodzące z szpiku kostnego znakowane LacZ izolowano od myszy Rosa26, jak opisano powyżej dla izolowania komórek SP SP i gdzie indziej (12), i przeszczepiano przez wstrzyknięcie orbitalne do letalnie napromieniowanych genetycznie dopasowanych biorców C57B1 / 6, jak opisano wcześniej (4). Wszczepienie komórek SP znakowanych LacZ do szpiku kostnego biorców monitorowano poprzez analizę krwi obwodowej dla aktywności FDG przy użyciu FACS, jak opisano powyżej. Po 5 lub 12 miesiącach po transplantacji, mięśnie szkieletowe kończyny tylnej stabilnie wszczepionych myszy (trzy myszy na każdy punkt czasowy) wycięto, strawiono, wybarwiono barwnikiem Hoechst, obciążono substratem FDG przez wstrząs hipotoniczny. Komórki następnie poddano FACS w celu wyizolowania populacji SP i nie-SP i wykrywania aktywności g-g w każdej populacji, jak opisano powyżej, w celu określenia, jaka część każdej z nich ekspresjonowała gen LacZ, a zatem pochodził ze szpiku kostnego. Uszkodzenie mięśni szkieletowych i dostarczanie komórek macierzystych. Aby przetestować potencjał naczyniowy komórek SP pochodzących z mięśni i innych niż SP w warunkach in vivo, niezależnie wstrzyknęliśmy każdą populację oznaczoną LacZ w uszkodzoną tkankę mięśniową i po 4 tygodniach przeanalizowaliśmy naprawioną tkankę w celu zaszczepienia zaznaczonych komórek SP i innych niż SP do układu naczyniowego. Myszy biorcy dla modeli urazu przygotowano w następujący sposób. Pokrótce, 6-8-tygodniowe genetycznie dopasowane myszy C57Bl / 6, 8 lub 24 godziny przed wstrzyknięciem komórek macierzystych, znieczulono za pomocą Avertiny i 25 .l kardiotoksyn mg / ml Naja mossambica mossambica (Sigma -Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) wstrzyknięto podłużnie obu mięśniom piszczelowym przednim (TA). Ta mieszanka toksyn wężowych indukuje degenerację włókien mięśniowych (14); uraz mięśniowy był związany z zapaleniem tylnej kończyny i kulejącym do 48 godzin po urazie. Mięśnie prawej kończyny TA następnie wstrzyknięto 500 000 komórek spoza SP lub 2000 komórek SP, a lewą nogę wstrzyknięto sam roztwór Hanksa. Po 4 tygodniach dolną muskulaturę kończyny tylnej zebrano i poddano obróbce w celu zamrożonego cięcia i analizy immunohistochemicznej. Cztery zwierzęta analizowano dla każdego badania wszczepienia komórek SP i nie w SP; kontrolowano i badano doświadczalną tkankę mięśniową od każdego ze zwierząt. Analiza immunohistochemiczna tkanek eksperymentalnych. Zamrożone skrawki (5 .m) eksperymentalnej tkanki mięśni szkieletowych wybarwiono immunologicznie za pomocą Abs wobec desminy (DAKO A / S, Glostrup, Dania; 1: 500) i ICAM-2 (PharMingen, klon 3C4; 1:50) w celu zidentyfikowania odpowiednio komórki mięśni gładkich i śródbłonka w strukturach naczyniowych. W celu barwienia immunologicznego desminy tkankę utrwalano przez 30 minut w 4% paraformaldehydzie przed pierwotną inkubacją Ab. W przypadku immunobarwienia ICAM-2 tkanka była podobnie utrwalana po pierwotnej inkubacji Ab. Przeciwciała anty-mysie lub anty-szczurze Alexa 488 lub 594 drugorzędowe Ab (Molecular Probes Inc.) zastosowano do desminy i immunobarwienia ICAM-2, odpowiednio.
[przypisy: jaka sukienka na studniówkę, przychodnia góra kalwaria, sinulan ulotka ]
[przypisy: najsmieszniejsze nazwiska, pro kolin, sinulan ulotka ]