Wyraźne populacje progenitorowe w mięśniach szkieletowych są pochodnymi szpiku kostnego i wykazują różne losy komórek podczas regeneracji naczyń ad

Trawioną tkankę osadzono i ponownie zawieszono, roztarto w HBSS i przepuszczono przez filtr 40 .m, uzyskując zawiesinę pojedynczych komórek. Komórki następnie frakcjonowano pod względem wielkości przez nakładanie warstw na gradient 40/70% Percoll i wirowanie przez 20 minut przy 1000 g w temperaturze pokojowej. Komórki na styku zostały poddane barwieniu Hoechst i FACS w celu wyizolowania komórek SP mięśni szkieletowych i komórek spoza SP. Szczegółowe informacje na temat izolowania komórek SP można znaleźć w poprzedniej publikacji (12) lub pobrać (www.bcm.tmc.edu/genetherapy/goodell). Pokrótce, frakcjonowane pod mikroskopem komórki mięśniowe zawieszono w 106 jądrowych komórkach na mililitr w DMEM z 2% FCS / 10 mM buforem HEPES / 5 ug / ml Hoechst 33342 i inkubowano przez 90 minut w 37 ° C. Komórki następnie inkubowano z jodkiem propidyny (2 .g / ml) w celu oznaczenia nieżywotnych komórek i poddano FACS. Profil fluorescencyjny komórek barwionych Hoechst pokazano na Figurze 1; Jony propidium-.-pozytywne (martwe) zostały wyłączone. Komórki SP mięśniowe aktywnie wypierają barwnik Hoechst i pojawiają się jako odrębna populacja komórek po stronie profilu; stąd nazwa komórki SP. Komórki spoza SP stanowią wyraźną i odtwarzalną populację komórek, która typowo zawiera około 70-80% żywotnych komórek mięśniowych frakcjonowanych w Percoll (patrz Figura 1). Analizę i zbieranie komórek przeprowadzono na potrójnym laserowym urządzeniu MoFlow (Cytomation Inc., Fort Collins, Colorado, USA) i dane analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo (Treestar Software, San Carlos, Kalifornia, USA). Preparaty cytospin wytworzono również z izolowanych komórek SP mięśniowych i innych niż SP. Figura 1Ilacja mysich progenitorów mięśni szkieletowych. (a) Komórki macierzyste mięśni szkieletowych izolowano od 6- do 8-tygodniowych myszy C57Bl / 6 lub Rosa26, frakcjonowano na gradiencie Percolla, barwiono barwnikiem Hoechst 33342 i poddawano FACS. Komórki SP i inne niż SP były wyraźnie rozpoznawalne na podstawie wykluczenia barwnika Hoechst, a odrębne populacje izolowano za pomocą FACS. (b) W tej reprezentatywnej próbie populacja SP wynosiła 0,21%, a nie-SP stanowiła 81,9% ogółu żywych komórek. (c) Zarówno populacje SP jak i spoza SP hodowano przez noc, a ich wyraźne morfologie ujawniono podczas mikroskopowego badania komórek w hodowli. Stwierdzono, że komórki SP mają jednolitą morfologię i są nieprzylegające. Populacja spoza SP zawierała głównie adherentne komórki w kształcie wrzeciona. Analiza populacji komórek macierzystych do ekspresji markerów naczyniowych. Całkowity RNA wyekstrahowano z frakcjonowanych w Percoll komórek mięśni szkieletowych, komórek mięśni SP i nie-SP oraz komórek szpiku SP z użyciem Trizol (Invitrogen Life Technologies Inc., Carlsbad, California, USA). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono na 50 ng traktowanego DNAse RNA, stosując sugerowany protokół dla zestawu Superscript II (Invitrogen Life Technologies Inc.). Przeprowadzono dwuetapową PCR stosując startery dla następujących genów, jak opisano wcześniej (4): CD34; cząsteczka adhezyjna płytki krwi śródbłonka-1 (PE-CAM-1); czynnik transkrypcyjny Scl / Tal-1 (Tal 1); Receptor VEGF-1 (Flt-1); Receptor VEGF-2 (Flk-1); VEGF-A; angiopoetyna-1 (Ang-1); kinaza tyrozynowa z immunoglobuliną i homogenem naskórkowego czynnika wzrostu (Tie-1); naczyniowo-śródbłonkowa kadheryna (VE-kadheryna); alfa aktyna mięśni gładkich (SM – y – aktyna); kalponina; desmin; i GAPDH. Startery przeciwko innym genom obejmowały: czynnik wzrostu hepatocytów / receptor czynnika scatter (c-met), 5a -GAATGTCGTCCTACACGGCC-3. naprzód, 5. -CACTACACAGTCAGGACACTGC-3. rewers; i ICAM-2, 5. -CATATGGTCCGAGAAGCAGA-3. do przodu, 5. -TGCACTCAATGGTGAAGTCT-3. rewers. Analizę z użyciem każdego zestawu starterów przeprowadzono na trzech do pięciu niezależnych izolatów RNA z każdej populacji komórek. Pozytywne (RNA wyizolowane z całego szpiku kostnego lub tkanki mięśniowej), negatywne (brak enzymu odwrotnej transkryptazy dodawanego do reakcji RT) i ładowanie (amplifikacja GAPDH) zostały uwzględnione we wszystkich próbach. Ponadto amplikon wytworzony z każdego zestawu starterów, przy użyciu kontrolnego RNA pochodzącego ze szpiku kostnego lub ze szpiku kostnego, wklonowano do wektora pGEM-T, stosując pGEM-T EasyVector System I (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) i sekwencjonowane w celu sprawdzenia, czy startery amplifikują zamierzony gen. Komórki badano również za pomocą cytometrii przepływowej w celu ekspresji białek powierzchniowych komórek. Komórki mięśnia SP i nie-SP wyizolowano jak opisano powyżej, a następnie odwirowano i zawieszono ponownie przy stężeniu 108 komórek / ml w zimnym HBSS zawierającym 2% FCS i 10 mM bufor HEPES (HBSS +). Komórki inkubowano z pierwszorzędowymi Abs przez 20 minut, przemywano w nadmiarze HBSS +, a następnie inkubowano z odczynnikami drugorzędowymi, w razie potrzeby, przez 20 minut przed ostatecznym przemyciem i ponownym zawieszeniem w HBSS +
[podobne: turnusy rehabilitacyjne krynica zdrój, najśmieszniejsze nazwiska w polsce, alzheimer pierwsze objawy ]
[podobne: mały weterynarz, isonasin, trosicam 15 mg ]