Wyrażanie CCR10 jest wspólną cechą komórek wydzielających Ab z komórek nabłonka i błon śluzowych nabłonka IgA cd

Biotynylowane mysie przeciwciała antyludzkie Ig (10 ug / ml) inkubowano przez 40 minut w temperaturze pokojowej i wykryto rozcieńczeniem SAV-FITC w stosunku 1: 150 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Kontrolne izotypy Ab. S wykryto w identyczny sposób. Bezpośrednio skoniugowane Ab były inkubowane przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Barwienie immunohistochemiczne wizualizowano za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego (MRC 1024, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) stosując oprogramowanie Lasersharp w wersji 2.1 (Bio-Rad Laboratories Inc.). Obrazy wielokolorowe powstały w wyniku nałożenia kilku obrazów jednokolorowych. Testy chemotaksji. Testy chemotaksji przeprowadzono zgodnie z opisem (20). W skrócie, wkładki Transwell (Corning Costar Corp., Cambridge, Massachusetts, USA) zawierające 2 x 106 migdałków migdałków umieszczono w studzienkach płytek 24-studzienkowych w kontakcie z 600 .l pożywki (RPMI-1640 z 0,5% BSA) z lub bez chemokiny. Po 2 godzinach do każdej studzienki dodano stałą objętość zliczających kulek (Polysciences Inc., Warrington, Pennsylvania, USA) w celu normalizacji, a specyficzną migrację wyliczono za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu pod kątem interesujących podzbiorów limfocytów. Ludzkie TECK, MEC i SDF-1A / CXCL12 zakupiono od Peprotech Inc. (Rocky Hill, New Jersey, USA). Cytometrii przepływowej. Nieskoniugowane mAb wykrywano stosując biotynylowany koński anty-mysie IgG wtórne Ab (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) i białko chlorofilowe streptawidyna-perydynina (streptawidyna-PerCP, PharMingen), lub kozie anty-mysi-PE F (ab .) 2 wtórne Ab (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Czterokolorową cytometrię przepływową wykonano na FACScalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA) stosując oprogramowanie CellQuest, wersja 3.1 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Wyniki Aby zidentyfikować podzbiory limfocytów tkankowych eksprymujące receptor chemokin CCR10, najpierw zbadaliśmy limfocyty T pamięci w różnych ludzkich tkankach nabłonkowych (Figura 1), gdzie również eksprymowany jest MEC (21, 22). Zaskakująco, cytometria przepływowa (Figura 1b) ujawniła, że CCR10 nie ulegał ekspresji na bardzo wielu limfocytach T pamięci nabłonkowej, chociaż jelito cienkie i, w mniejszym stopniu, okrężnica i żołądek, zawierały limfocyty CCR9 +, jak pokazano wcześniej (14, 15). . Ani świeżo wyizolowane limfocyty T, ani komórki inkubowane w temperaturze 37 ° C przez godzinę nie wykazywały barwnego wykrywania mAb anty-CCR10. Ponadto, niewiele, jeśli w ogóle, limfocytów T pamięci eksprymujących CCR10 można było wykryć w migdałkach lub wyrostku robaczkowym. Immunohistochemia różnych tkanek nabłonka błony śluzowej również nie ujawniła ekspresji CCR10 na komórkach T pamięci tkankowej (Figura 1a). Tak więc wydaje się, że ekspresja CCR10 na limfocytach T jest charakterystyczna dla limfocytów pamięci bazujących na CLA + skóry (18, 19), ale nie na populacjach komórek T dużej śluzówki w tych tkankach. Figura 1CCR10 jest wyrażana na kilku limfocytach T tkanki żołądkowo-jelitowej. (a) Zamrożone skrawki tkanek nabłonkowych zostały poddane barwieniu za pomocą Abs przeciwko CD3 (limfocyty T, zielony), CCR10 (czerwony) i CD20 (naiwny, pamięć i limfocyty B GC, niebieski). Brak koekspresji CCR10 z CD3 lub CD20 pokazuje, że komórki eksprymujące CCR10 w tych tkankach nie są komórkami T ani B pamięci. (b) Limfocyty T z różnych odcinków przewodu żołądkowo-jelitowego i migdałka izolowano i barwiono pod kątem CD4 + lub CD8 + (i markera CD45RA) w połączeniu z CCR10 lub CCR9. CCR10 jest praktycznie nieobecny na komórkach T w tych tkankach (<5% komórek T CCR10 + w dowolnej badanej tkance), podczas gdy CCR9 jest wyrażany na prawie wszystkich komórkach T z jelita cienkiego (85%> 11% w jelicie czczym i 87%. 9 % w jelicie krętym) i subpopulacji limfocytów T w okrężnicy (15%. 8%) i żołądka (11%. 6%), jak opisano (14). Dane immunohistochemiczne są reprezentatywne dla trzech gruczołów ślinowych, pięciu jelita czczego, trzech jelita krętego, dwóch dwunastnicy, czterech jelita grubego i trzech próbek wyrostka robaczkowego (oraz trzech próbek migdałków i trzech żołądków, których nie pokazano). Dane z cytometrii przepływowej są reprezentatywne dla dwóch próbek: migdałka, trzy żołądka, trzy jelita czcze, trzy jelita krętego, trzy okrężnice i dwie próbki wyrostka robaczkowego o średniej. Pokazano SD. Procent komórek pozytywnych względem CCR10 lub CCR9 w oparciu o kwadrant obejmujący 3% komórek barwionych kontrolą izotypową w dot-blotach. U myszy odkryliśmy, że TECK, nabłonkowy ligand chemokiny dla CCR9 (15), jest chemotaktyczny dla komórek wydzielających Ab jelitowych IgA (16). Ponieważ TECK jest blisko spokrewniony z MEC (21, 22), zdecydowaliśmy się zbadać ekspresję CCR10 na głównej populacji komórek B znajdujących się w tkankach nabłonka błony śluzowej: komórce plazmatycznej (Figura 2). U ludzi markery do różnicowania komórek B są dobrze scharakteryzowane (25, 26)
[przypisy: przyczyny suchego kaszlu, rozpiska ćwiczeń na siłowni, przeglądarka skierowań sanatoryjnych nfz ]
[patrz też: flucontrol max, bioxetin opinie, jak oduczyć psa skakania po ludziach ]