Wyrażanie CCR10 jest wspólną cechą komórek wydzielających Ab z komórek nabłonka i błon śluzowych nabłonka IgA ad

Plazmable Tonsilu eksprymujące CCR10 chemotax do MEC i około 70% krążących plazmariów IgA eksprymują CCR10, co sugeruje, że plazmidy krwi IgA mogą być zlokalizowane i zlokalizowane wewnątrz komórek nabłonka śluzówkowego z ekspresją MEC przy użyciu CCR10. Odkrywamy również, że w ludzkim, jak w mysim systemie, CCR9 jest wyrażany w podzbiorze krążących plazmasm IgA i na podgrupie komórek plazmatycznych IgA w jelicie cienkim, co sugeruje bardziej ograniczoną rolę dla CCR9 i TECK w jelicie cienkim IgA. odporność. Podsumowując, wyniki te sugerują rolę CCR10 i MEC w ujednolicaniu lokalizacji komórek plazmatycznych IgA z fizycznie zdyspergowanymi narządami wydzielniczego układu odpornościowego IgA. Zatem prawdopodobne jest, że indukcja CCR10 na specyficznych dla patogenu komórkach B wydzielających IgA może być ważnym czynnikiem dla pomyślnego rozprzestrzeniania się ochrony zależnej od IgA po miejscowej infekcji lub szczepieniu śluzówki. Metody Ab i odczynniki. Anty-ludzkie mAb CCR10 37 (mysie IgG1), 1908 (mysie IgG1) i 1363 (mysie IgG2a) wytworzono przez immunizację myszy mysimi komórkami brekofolami BAF / 3 transfekowanymi ludzkim CCR10, jak opisano (19). Anty-ludzkie mAb CCB1B 1B5 (mysia IgG2a) wytworzono przez immunizację myszy ludzkimi komórkami L1 / 2 transfekowanymi CCR10 (linia komórek preAB) w Millenium Pharmaceuticals Inc. (Cambridge, Massachusetts, USA). Wszystkie cztery mAb CCR10 wykazywały praktycznie identyczne wzorce barwienia na krwi i limfocytach tkankowych, gdy testowano je za pomocą cytometrii przepływowej lub immunohistochemii. Opisano przeciwciała anty-ludzkie CCR9. 3C3 (mysie IgG2b) i 96-1 (mysie IgG1) (14, 15). Nieskoniugowane kontrolne izotypy uzyskano z Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), a kontrolę izotypową IgG1-biotyna otrzymano z PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA). Anty-ludzkie mAb CCR6 (mysie IgG2b, klon 53103.111) otrzymano z R & D Systems Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA). Bezpośrednio skoniugowany mysi anty-ludzki CD3-APC (IgG1, klon UCHT1), CD4-fikoerytryna (CD4-PE) (IgG1, klon RPA-T4), CD8-PE (IgG1, klon RPA-T8), CD45RA-FITC (IgG2b) klon HI100), CD20-APC (IgG2b, klon 2H7), CD19-PE (IgG1, klon HIB19), IgD-FITC (IgG2a, klon 1A6-2), CD14-FITC (IgG2a, klon M5E2), CD94-FITC (IgG1, klon HP-3D9) i CD38-FITC (IgG1, klon HIT2) pochodziły z PharMingen. Anty-ludzka IgAl / 2-biotyna (IgG1, klon G20-359) i IgG-biotyna (IgG1, klon G18-145) pochodziły z PharMingen. EDTA pochodziła z Sigma-Aldrich. Tkanki i izolacja limfocytów. Prawidłowe ludzkie migdałki, żołądek, jelito czcze, jelito kręte, okrężnicę i wyrostek robaczkowy uzyskano od pacjentów poddawanych różnym zabiegom chirurgicznym. Wszystkie protokoły dla ludzi zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Stanforda. Niektóre tkanki uzyskano w postaci zamrożonych próbek w OCT z Wydziału Patologii Uniwersytetu Stanforda lub Sieci Tkanek Ludzkich Spółdzielni (Western Division, Nashville, Tennessee, USA). Limfocyty z blaszki właściwej ludzkiego przewodu żołądkowo-jelitowego izolowano jak opisano wcześniej (14) bez żadnej obróbki enzymatycznej. Pokrótce, kawałki tkanki rozcięto, uło.ono na płasko i przemyto lodowatym HBSS. Surowice oddzielono od błony śluzowej i odrzucono. Błona śluzowa została pocięta na paski, a następnie inkubowana w zimnym mM EDTA / HBSS z ciągłym mieszaniem przez 30 minut w celu usunięcia nabłonka i limfocytów śródnabłonkowych (ten etap powtórzono kilka razy, aż do momentu, gdy nie wystąpiło już złuszczanie nabłonka). Pozostałe paski błony śluzowej zostały zmiażdżone przez filtr siatkowy o wielkości oczek 50 (Sigma-Aldrich) w celu wyizolowania limfocytów blaszki właściwej. Limfocyty migdałka i wyrostka robaczkowego wyizolowano przez zdyspergowanie tkanek przez siatkę drucianą, a następnie hipotoniczną lizę erytrocytów. Wcześniej ustaliliśmy (14), że nieenzymatyczne leczenie stosowane do izolacji limfocytów z tych tkanek nie wpływa na receptor chemokinowy, cząsteczkę adhezyjną ani ekspresję markera. Ludzkie leukocyty jednojądrzaste krwi obwodowej (PBML) wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie Ficoll (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA). W celu analizy krążących plazmariów IgA, PBML zostały pozbawione komórek T przed barwieniem za pomocą kulek magnetycznych anty-CD3 (Dynal Inc., Lake Success, New York, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Immunohistochemia. Zamrożone skrawki różnych tkanek osadzonych w OCT utrwalano przez 10 minut w zimnym acetonie, suszono w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie ponownie uwodniono przez 30 minut w PBS. Tkanki następnie blokowano 25% surowicą kozią przez 10 minut przed inkubacją z pierwotnymi (nieskoniugowanymi mAb CCR10, 10 (ag / ml) lub wtórnym Ab (koza PE przeciw mysiemu F (ab.) 2, 1: 100; Jackson; ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) przez 40 minut w temperaturze pokojowej
[patrz też: rozpiska ćwiczeń na siłowni, mały weterynarz, przychodnia góra kalwaria ]
[hasła pokrewne: pro kolin, sinulan ulotka, jak oduczyć psa skakania ]