Transportery ABC i NR4A1 identyfikują spoczynkowy podzbiór komórek T pamięci rezydujących w tkankach ad 8

Wewnątrzkomórkowe barwienie przeprowadzono stosując odczynniki BD zgodnie z protokołem producenta. Przeciwciała cytometrii przepływowej dla ludzi i myszy zakupiono z BD, eBioscience i BioLegend. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano na BD LSRII z oprogramowaniem Diva i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo 9.7.7 (Treestar). Zastosowano następujące przeciwciała znakowane fluorescencyjnie: anty ludzkiego CD3 (klon UCHT1, BioLegend), anty ludzkiego CD4 (klon RPA-T4, BD Biosciences), anty ludzkiego CD8 (klon SK1, BD Biosciences), anty ludzkiego CD69 (klon FN50; eBiosciences ), anty ludzkie CD103 (klon B-Ly7, eBiosciences), anty ludzkie CD62L (klon DREG-56, eBiosciences), anty ludzkie CCR7 (klon G043 H7, BioLegend), anty ludzkie CD45RO (klon UCHL1, BD Biosciences), anty ludzkie IFN-. (klon B27, BD Biosciences), anty ludzkie CD45RA (klon HI 100, eBiosciences), anty-mysie CD4 (klon RM4.5, BD Biosciences), anty-mysie CD8 (klon 53-6,7, BD Biosciences), anty-mysie CD69 (klon HI.2F3; eBiosciences), anty-mysie CD103 (klon 2E7; eBiosciences), anty-mysie CD62L (klon MEL-14; eBiosciences), anty-mysie CD44 (klon IM7; eBiosciences), anty myszy Thy1.1 (klon OX-7; BD Biosciences), przeciw myszy CD45.2 (klon 104; eBiosciences), przeciw myszy CD45.1 (klon A20, eBiosciences), przeciw myszy IFN-y (klon XMG1.1, BD Biosciences) i mysie TCR V. 2 (klon B20.1; BioLegend). Wykrywanie komórek Tsp. Barwienie Hoechst przeprowadzono na zawiesinie pojedynczych komórek myszy i komórek ludzkich w ilości do 2 milionów komórek / ml, stosując metodę opisaną przez Goodell i in. (13). W skrócie, komórki inkubowano z Hoechst 33342 (5 .g / ml) (Sigma-Aldrich) w 2% FCS i mM HEPES z lub bez werapamilu (50 .M) (Sigma-Aldrich) przez 90 minut w 37 ° C. w inkubatorze w ciemności z przerywanym drżeniem. Komórki następnie przemyto w lodowatym buforze do przemywania Hoechst i analizowano za pomocą lasera UV BDYRRIIa. Barwienie Hoechst-Pyronin Y. Analizę G0 / G1 wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (24). W skrócie, komórki inkubowano w buforze Hoechst 33342 przez godzinę w 37 ° C. Następnie dodano Pyronin Y (5 ug / ml, Sigma-Aldrich) i komórki inkubowano przez dodatkowe 30 minut. Następnie komórki przemyto lodowatym buforem i analizowano za pomocą BD-LSRII. Adoptywny transfer ludzkich komórek T do myszy NSG. Ludzkie komórki Tsp i kontrolne komórki T sortowano FACS i przenoszono adoptywnie przez iniekcję dożylną za pomocą 50 do 100 x 1000 komórek T / mysz. Aby zmniejszyć zmienność w każdym eksperymencie, 3 replikowane myszy z każdej grupy otrzymały posortowane komórki Tsp lub kontrolne komórki T od tego samego dawcy. Myszy uśmiercono w 8 do 10 tygodni. Narządy takie jak skóra, wątroba i jelito cienkie były testowane pod kątem patologii tkanek. Śledzionę zebrano i wytworzono zawiesiny pojedynczych komórek i wybarwiono na obecność FACS w celu wykrycia wszczepienia ludzkich komórek T. Adopcyjne przeniesienie mysich limfocytów T CD8 + SP. Chimery P14 (Thy 1.1+) wytworzono i zakażono LCMV. Po 30 dniach od zakażenia komórki SP CD8 + T (zawierające zarówno SP Thy 1.1+, jak i poliklonalne SP CD8 + komórki T) sortowano i przenoszono do myszy RAG. W 3 tygodnie po przeniesieniu, obecność komórek Trm w komórkach jelita i Tcm / Tem w śledzionie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Sekwencjonowanie TCR. Genomowy DNA wyizolowano z limfocytów T CD8 + z limfocytów obwodowych lub komórek MAIT (CD8 + CD161 + IL18Ry +), a różnorodność TCR profilowano przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania zmienionego TCR. loci z genomowego DNA według Adaptive Biotechnologies, jak opisano wcześniej (43). Analiza mikromacierzy. RNA z sortowanych ludzkich komórek SP CD4 + i CD8 + powielono, wyznakowano i hybrydyzowano na mikromacierzy Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0. Dane analizowano za pomocą oprogramowania Gene Spring GX12.5 (Agilent Technologies) i Partek Genomics Suite (6.6), jak opisano wcześniej (44, 45). Wszystkie oryginalne dane z mikromacierzy zostały zdeponowane w Gene Expression Omnibus NCBI (GEO GSE85074). Immunohistochemia. W każdym doświadczeniu badano cztery do pięciu myszy na grupę (8 do 12 tygodni). Myszy zostały adoptatywnie przeniesione za pomocą Tsp i kontrolne komórki T. Po 4 tygodniach transferu myszy uśmiercano, a narządy (skóra, wątroba i jelito cienkie) badano pod kątem GVHD. W skrócie, skrawki tkanek przygotowane z tkanek utrwalonych w formalinie zastosowano do barwienia H & E. Uzyskany wynik punktowy był oparty na patologii tkanek. Myszy Histone 2BGFP. Myszy H2B-GFP (25) zakupiono w Jackson Laboratory. Sześciotygodniowe myszy karmiono Dox (Sigma-Aldrich, D9891, 2 mg / ml, z dodatkiem sacharozy przy 10 mg / ml) dodawano do wody pitnej przez 2 do 3 tygodni. Myszy następnie infekowano ramieniem LCMV i trzymano w Dox przez 5 dodatkowych tygodni Po 8 tygodniach leczenia Dox, rozpoczęto pościg odstawienia Dox na kolejne 5 tygodni. Myszy następnie poddano eutanazji i analizowano pod kątem komórek zatrzymujących znaczniki. Statystyka. Do porównania danych między dwiema grupami użyto testu dwustronnego ucznia. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Zatwierdzenie badania. Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Używania Zwierząt, a badania na ludziach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badania Ludzkiego na Uniwersytecie Yale. Osoby uczestniczące w badaniu naukowym przed podjęciem udziału w badaniu wyraziły świadomą zgodę. Wkład autorówCSB zaprojektował i przeprowadził badania, przeanalizował dane i napisał manuskrypt. SN przeprowadził badania i przeanalizował dane. SMG i HNN przeprowadzili pewne eksperymenty. RV analizowało dane mikromacierzy. JAG analizował patologię myszy. Dane analizowane przez CA, JV, KMD, CCH, RAF i DN. SMK zaprojektował badania i przeanalizował dane. MVD zaprojektował badania, przeanalizował dane i napisał manuskrypt. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Autorzy dziękują członkom laboratorium Dhodapkar za pomocne dyskusje oraz Lin Zhang i Connor Foster za pomoc w przetwarzaniu próbek. MVD jest częściowo wspierane przez fundusze z NIH (CA106802, CA197603). Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2016; 126 (10): 3905. 3916. doi: 10.1172 / JCI85329.
[przypisy: afobam działanie, przyczyny suchego kaszlu, mały weterynarz ]
[więcej w: aglan cena, afobam działanie, damar ruda śląska ]