Synergia między kaskadą plazminogenu a MMP-9 w chorobie autoimmunologicznej ad 8

Stężenie białka oznaczano za pomocą testu wiązania barwnika Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories), stosując standard BSA. MMP-9 w ekstraktach białkowych skrawków skórnych zwierząt z iniekcją i supernatantów stymulowanych granulocytow obojętnochłonnych oznaczono metodą zymografii żelatynowej, jak opisano wcześniej (27, 67). Poziomy aktywnych MMP w ekstraktach białkowych skóry oznaczano ilościowo za pomocą zestawu do kolorymetrycznego oznaczania MMP zgodnie z instrukcjami producenta (BIOMOL). Pokrótce, próbki białka inkubowano z kolorymetrycznym substratem MMP Ac-PLG [2-merkapto-4-metylo] -LG-OC2H5 w buforze reakcyjnym (końcowe stężenie substratu, 100 .M) w 37 ° C. Aktywność MMP w ekstraktach białkowych mierzono zmianą OD przy 412 nm i wyrażano jako względną aktywność MMP (odczyt OD412nm / min / mg białka skóry myszy wstrzyknięto patogennym IgG minus odczyt OD412nm / min / mg białka skóry myszy wstrzykniętej normalna kontrola IgG). Aktywność plazmininy w ekstraktach skórnych myszy mierzono stosując chromogenny substrat Val-Leu-Lys-p-nitroanilid (Sigma-Aldrich) (68). Ekstrakty białka skóry inkubowano z 0,6 mM substratu w 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 110 mM NaCl. Odczytano absorbancję przy 405 nm. Tło z powodu nakładających się aktywności innych proteaz serynowych określono przy użyciu ekstraktów skóry plus inhibitora plazminy a2-AP. Aktywność plazmininy wyrażono jako względną aktywność plazminy (OD405nm / mg białka minus OD405nm / mg białka w obecności a2-AP). Kwantyfikacja aktywności NE i AP-PI. Aktywność NE w skórze myszy mierzono za pomocą substratu specyficznego dla NE metoksyscynylo-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanalidu (Met-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA; Enzyme Systems Products) jako wcześniej opisane (28). Aktywność NE w tkance wyrażono jako względną aktywność NE (białko OD420nm / min / mg). W celu ilościowego oznaczenia poziomów aktywności .1-PI w skórze, zastosowano test hamowania NE. W skrócie, oczyszczony NE inkubowano z różnymi ilościami oczyszczonego Ai-PI w 25 ° C przez 5 minut, a następnie dodano substrat specyficzny dla NE. Pozostające aktywności NE zmierzono przez odczyt z 420 nm jak powyżej i wygenerowano krzywą standardową hamowania NE3. Aktywność tkanki 1-PI określono przez monitorowanie zmiany absorbancji przy długości fali 420 nm i wyrażono jako względną aktywność a-1-PI (1