Synergia między kaskadą plazminogenu a MMP-9 w chorobie autoimmunologicznej ad 7

Chociaż wiele substratów dla plazmin zostało zidentyfikowanych in vitro, substraty w tych stanach patologicznych pozostają w dużej mierze nieznane. Niniejsze badanie wskazuje na MMP-9 jako krytyczne podłoże dla plazminy w pęcherzykach podnaskórkowych. Aktywowane MMP-9 i inne enzymy proteolityczne uszkadzają białka błony podstawnej, powodując BP. Wyjaśnienie roli układu Plg / plazmin w BP daje nam nowy wgląd w immunopatogenezę chorób autoimmunologicznych i sugeruje, że ten układ proteolityczny jest potencjalnym celem interwencji terapeutycznej. Metody Odczynniki. Oczyszczoną mysią MMP-9 otrzymano z Triple Point Biologics Inc. Proenzym MMP-9 aktywowano przez inkubację w 37 ° C przez 4 godziny z octanem aminofenylortęci w mM, i inkubowaną mieszaninę następnie dializowano wobec PBS w 4 ° C w celu usunięcia octanu aminofenylortęci. Oczyszczone mysie białko Plg zakupiono z American Diagnostica Inc. Ludzkie plazminy, ludzkie a-1-AC, ludzkie a-1-PI, ludzkie a2-AP, ludzki NE i ludzki neutrofil MPO pochodziły z Athens Research and Technology Inc. Animals. C57BL / 6J, Plgp / p, tPA p / p i uPA A / p myszy zakupiono w Jackson Laboratory. MMP-3. /. myszy uzyskano z Taconic. MMP-9. /. i dopasowane myszy normalnej kontroli (+ / +) wytworzono jak opisano wcześniej (65). Myszy z niedoborem zarówno tPA, jak i uPA (tuPA. /.) Wytworzono przez skrzyżowanie tPA. /. i uPA. /. myszy, a następnie krzyżowanie heterozygotycznego potomstwa. Tożsamość niedoboru tuPA została potwierdzona przez zymografię kazeinową (patrz poniżej). Pary hodowlane tych myszy były utrzymywane w Medical College of Wisconsin Animal Resource Centre oraz w Wydziale Laboratoryjnej Medycyny Zwierzęcej na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill. Nowonarodzone myszy, w wieku 24 do 48 godzin, o wadze 1,4 . 2,0 g, stosowano do eksperymentów przenoszenia pasywnego. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Studiów na Zwierzętach Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill School of Medicine i były zgodne z wytycznymi NIH. Przygotowanie patogennych przeciwciał anty-BP180 i indukcja eksperymentalnego BP. Przygotowanie rekombinowanego mBP180 i immunizację królików przeprowadzono jak opisano wcześniej (23). Miana króliczych przeciwciał anty-mBP180 w surowicach królika i oczyszczonych frakcjach IgG badano za pomocą pośredniej immunofluorescencji, stosując kriosekcję skóry myszy jako substrat (23). Patogeniczność tych preparatów IgG zbadano w doświadczeniach z pasywnym transferem, jak opisano poniżej. W celu indukcji eksperymentalnego BP i oceny klinicznej noworodkom podano zastrzyk śródskórny (id) (50 ul, 2,64 mg / g masy ciała) sterylnego roztworu IgG w PBS, jak opisano w innym miejscu (23, 24). Skórę noworodków myszy z grup testowych i kontrolnych badano 12. 72 godzin po wstrzyknięciach IgG. Aktywność choroby skórnej oceniono w następujący sposób: 0, brak wykrywalnej choroby skóry; 1+, łagodna rumieniowa reakcja bez oznak. Oderwania naskórka. (Oderwanie naskórka zostało wywołane delikatnym tarciem skóry, które, gdy jest pozytywne, wytworzyło drobne, uporczywe marszczenie się naskórka); 2+, intensywny rumień i oderwanie naskórka obejmujące 10. 50% naskórka w miejscu wstrzyknięcia; i 3+, intensywny rumień z całkowitym oderwaniem naskórka obejmujący więcej niż 50% naskórka w miejscu wstrzyknięcia. Aktywność choroby w każdej grupie myszy wyrażono jako średnią ocenę aktywności choroby (patrz Tabela 1). Wstrzyknięcie Plg, MMP-9, A 1-AC i A 2-AP. Noworodkom myszy wstrzyknięto id 50 ul ludzkiego a-1 AC (25 ug / g masy ciała), ludzką AP-2 (25 ug / g masy ciała), mysz Plg (5 ug / g masy ciała). ) lub mysiej MMP-9 (2,5 g / g masy ciała) przed wstrzyknięciem patogennej IgG (2,64 mg / g masy ciała). Skórę badano w różnych punktach czasowych pod kątem uszkodzeń klinicznych. Miejsca wstrzyknięcia IgG wycięto i ekstrahowano w celu analizy nacieku neutrofili i aktywności enzymów. Poziomy endotoksyn w preparatach Plg, MMP-9, A-AC i AP-AP były minimalne: myszy, którym wstrzyknięto te same odczynniki, nie wykazywały odpowiedzi zapalnej w skórze, jak określono za pomocą testu aktywności enzymu MPO (patrz poniżej). Oznaczenia MPO, MMP-9 i plazminy. W celu kwantyfikacji nagromadzenia PMN w skórze, aktywność MPO w tkankach w miejscach wstrzykniętych zwierząt badano jak opisano uprzednio (66), stosując oczyszczone MPO w standardzie. Aktywność MPO w supernatantach mierzono zmianą OD przy 460 nm wynikającą z rozkładu H2O2 w obecności o-dianizydyny. Zawartość MPO wyrażono jako względną aktywność MPO (odczyt OD460 nm / mg białka skóry myszy, którym wstrzyknięto patogenne IgG anty-mBP180 minus odczyt OD460nm / mg białka skóry myszy wstrzyknięto kontrolną IgG)
[więcej w: krem ziaja liście manuka, disnemar xylo, jak oduczyć psa skakania na ludzi ]
[przypisy: disnemar xylo, hubert jarczak wikipedia, chitinin extra ]