Przewlekłe zapalenie tłuszczu odgrywa kluczową rolę w rozwoju oporności na insulinę związanej z otyłością ad

Opisaliśmy również różnice morfologiczne między WAT typu dzikiego i ob różnymi metodami. Na podstawie naszych danych postawiliśmy hipotezę, że aktywność zapalna związana z makrofagami w WAT odgrywa aktywną rolę w indukowanej przez otyłość insulinooporności. Metody Modele myszy. Samce myszy z genetycznie otyłymi / cukrzycowymi modelami ob / ob, db / db, agouti i tubby w szczepie C57BL / 6J, wraz z kontrolami z miotu, zakupiono w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Te myszy karmiono standardową karmą (Farmer s Exchange, Framingham, Massachusetts, USA). W przypadku badań nad otyłością wywołaną dietą (DIO), poczynając od wieku 4-5 tygodni, myszy C57BL / 6J typu dzikiego z laboratorium The Jackson zostały wprowadzone do diety zawierającej 10%, 45% lub 60% kcal z tłuszczu (Research Diets) Inc., New Brunswick, New Jersey, USA). W przypadku badań profilowania transkrypcyjnego myszy z otyłością genetyczną o wczesnym początku (ob / ob i db / db) uśmiercono w 15 tygodniu życia; myszy z późną postacią otyłości genetycznej (aguti i tubby) uśmiercano w wieku 25 tygodni; myszy z otyłością indukowaną dietą (45% kcal z tłuszczu) uśmiercono w 20 tygodniu życia po 16 tygodniach diety o wysokiej zawartości tłuszczu. Zwierzęta wykorzystywane do śledzenia progresji do otyłości uśmiercono po 0, 3, 6, 8, 11, 16 i 26 tygodniach diety wysokotłuszczowej (60% kcal z tłuszczu). Tkanki i płyny ustrojowe zebrane dla tej pracy to najądrzaki WAT, wątroba, mięśnie szkieletowe (brzuchatoskrzydłe i mięsień czworogłowy), płuco, śledziona i krew. W przypadku leczenia rozyglitazonem 8-tygodniowe samce myszy ob / ob z The Jackson Laboratory aklimatyzowano przez tydzień. Rozyglitazon lub zaróbkę (sterylną wodę) podawano doustnie raz dziennie w dawce 15 mg / kg przez 28 kolejnych dni. Pod koniec badania myszy uśmiercano przez inhalację CO2, a najądrowe tampony tłuszczowe wycinano w celu ekstrakcji RNA. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Millennium Pharmaceuticals Inc. Zbieranie tkanek, przygotowanie całkowitego RNA i ilościową reakcję PCR. Myszy uśmiercano przez inhalację CO2. Tkanki zebrano i natychmiast zamrożono w ciekłym azocie. W celu uzyskania całkowitego RNA, tkanki zmielono na drobny proszek w ciekłym azocie i homogenizowano w roztworze Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA). RNA wyizolowano zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku WAT warstwę oleju powierzchniowego usunięto przed ekstrakcją chloroformem, aby zapewnić lepszą jakość RNA. TaqMan ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono i analizowano zgodnie z instrukcjami producenta (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Izolacja adipocytów, komórek zrębowych i pierwotnych makrofagów. Izolację adipocytów i komórek zrębu przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (16). Pięć dni przed izolacją makrofagów samcom myszy C57BL / 6J wstrzyknięto 2 ml pożywki hodowlanej tioglikolanu BBL (Becton Dickinson and Co., Sparks, Maryland, USA). Myszy uśmiercano przez inhalację CO2, a jamy otrzewnej przemywano zimnym sterylnym PBS w celu zebrania makrofagów. Po usunięciu krwinek czerwonych, makrofagi ponownie zawieszono w RPMI zawierającym 10% dezaktywowanej termicznie FBS i wysiano na płytki o średnicy 10 cm. Po 3 godzinach inkubacji komórki przemyto trzy razy PBS i dodano roztwór Trizolu do ekstrakcji RNA. Immunohistochemia i hybrydyzacja in situ. Świeżo mrożone sekcje WAT cięto w celu hybrydyzacji in situ. Sondy generowano za pomocą RT-PCR z mRNA wyizolowanego z WAT ze starterami swoistymi dla genu, ogonowanymi z sekwencjami promotorowymi T3 (sens) i T7 (antysens). Hybrydyzację przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (17). W momencie składania ofiar, części WAT zamrożono błyskawicznie w ciekłym azocie lub utrwalono w 4% paraformaldehydzie lub fix Bouina (Poly Scientific R & D Corp., Bay Shore, New York, USA). Po odwodnieniu wraz ze wzrostem stężenia etanolu, tkanki inkubowano w ksylenach, a następnie zatopiono w parafinie w temperaturze 60 ° C. Siedem mikronów wycięto na mikrotomie i zamontowano na szkiełkach. Próbki odparafinowano, ponownie uwodniono, wybarwiono błękitem toluidynowym O, odbarwiono i odwodniono. Dodano roztwór montażowy i szkiełka nakrywkowe. Skrawki parafinowe WAT barwiono również przeciwciałem przeciw mysiemu F4 / 80 (Serotec Inc., Raleigh, North Carolina, USA). Pierwotne przeciwciało było biotynylowane. Przed inkubacją z przeciwciałem, sekcje blokowano za pomocą biotyny i awidyny. Endogenna aktywność peroksydazy została zablokowana przez wstępne traktowanie 0,06% H2O2 w metanolu. Endogenny receptor Fc zablokowano 20% FCS w PBS. Skrawki inkubowano w pierwotnych przeciwciałach (rozcieńczenie 1: 100) przez godzinę, a następnie przemyto PBS / 0,05% Tween-20.
[więcej w: krem ziaja liście manuka, tabcin ulotka, nfz warszawa leczenie uzdrowiskowe ]
[patrz też: disnemar xylo, tabcin ulotka, chitinin extra ]