Przeciążenie żelazem zmniejsza miażdżycę u myszy z niedoborem apoE cd

Granica wykrywania (sygnał / szum> 10) była mniejsza niż pmol dla wszystkich aminokwasów. Jony stosowane do wykrywania analitu i wzorca wewnętrznego to: fenyloalanina, m / z 383 i 389 jonów; tyrozyna, m / z 417 i 423 jony; orto-tyrozyna, m / z 595 i 601 jonów; o, o-dityrozyny m / z 1208 i 1220 jonów. Blisterkowalne żelazo z chemioterapią. Stężenia żelaza chelatowanego bleomycyną mierzono metodą Gullidge a i in. (29, 30). Roztwory przepuszczono przez kolumnę Chelex (Bio-Rad Life Science Research Group, Hercules, California, USA) w celu usunięcia jonów metali przejściowych. Tkanka wątrobowa, zebrana w buforze bez DTPA (30 mg w 300 ul 150 mM NaCl), została zhomogenizowana i odwirowana przy 10 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 ° C. Supernatant usunięto, ponownie odwirowano i próbkę supernatantu rozcieńczono 1:50 wodą. Zawartość białka w supernatancie oznaczono metodą Lowry ego. Mysią surowicę odwirowano przy 10 000 g przez 10 minut. Próbkę supernatantu tkanki lub surowicy (5 ml, rozcieńczonego 1: [obj./obj.] Za pomocą wody) dodano do 200 ul DNA grasicy cielęcej (1 mg / ml), 10 ul bleomycyny (1,5 U / ml), 50 ul MgCl (50 mM) i 50 ul Tris (1 M, pH 7,4) w 1,5 ml probówce do mikrowirowania. Świeżo przygotowany askorbinian (25 ul 7,5-mM roztworu) dodano i mieszaninę inkubowano w 37 ° C przez godzinę. Po dodaniu 50 .l EDTA (100 mM), 250 .l kwasu tiobarbiturowego (1% [wag./obj.] W 50 mM NaOH) i 250 .l HCl (3 N), próbkę ogrzewano w 85 ° C przez 20 minut. Próbki wirowano, wirowano przy 10 000 g przez 10 minut, a supernatanty analizowano za pomocą spektrofotometru Beckman DU7 (Beckman Instruments Inc. Fullerton, Kalifornia, USA). Krzywa standardowa przygotowana z roztworami siarczanu żelazawego została użyta do obliczenia stężenia wolnego żelaza. Aby skorygować niespecyficzną absorbancję, odjęliśmy A512 z A532. Kwantyfikacja mRNA. Całkowite RNA w wątrobie wyizolowano za pomocą odczynnika do izolacji z Tripure (Roche Molecular Biochemicals Inc.). Następnie mRNA wyizolowano przy użyciu systemu Polytract mRNA Isolation System IV (nr katalogowy Z5310, Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) i rozdzielono na żelu denaturującym 1,2% agarozę przed przeniesieniem na membrany nylonowe (Nytran Plus; Schleicher & Schuell Inc. ). Sondy cDNA do hybrydyzacji ze specyficznymi mRNA wytworzono w dwuetapowym procesie z zastosowaniem PCR. Najpierw przeprowadzono RT-PCR stosując mRNA wyizolowany z myszy C57BL / 6 karmionych karmą dla gryzoni jako matrycą do wytworzenia małych ilości DNA. Po drugie, ten DNA został użyty jako matryca do generowania sond do analizy Northern blot. Startery zaprojektowano przy użyciu Primer 3 Output (31) na podstawie informacji o sekwencji w GenBank (32). Zastosowanymi sekwencjami starterowymi były: oksydaza L-gulono-a-laktonowa, 5a-TGCCACAGTTCCACCTTCT i 3a-GGTTGCTGCTCTCCTTCTTG; katalaza, 5a-CCTCGTTCAGGATGTGGTTT i 3a-CTGGTCGGTCTTGTAATGGA; surowiczy amyloid A (SAA), 5a-TGACAGCCAAAGATGGGTC i 3a-TGGGAACAACAG-GAAGAGAAA; hema oksygenaza, 5 (3 -ACTGGTGATGGCTTCCTTGT i 3a-TGAGGGACTCTGGTCTTTGTG; dysmutaza ponadtlenkowa manganu (MnSOD), 5a-GAGAGCAGCGGTCGTGTAA i 3a-CCTTATTGAAGC-CAAGCCAG; CuZn dysmutaza ponadtlenkowa (CuZnSOD), 5a-CTTCTCGTCTTGCTCTCTCT i 3a-CTTCATTTCCACCTTTGCCC; zewnątrzkomórkowy eCuZnSOD, 5a-TGGTTGAGAAGATAGGCGACA i 3a -CCCAAGATGGAGTGCGGT; peroksydaza glutationowa, 5 (3-GGACTACACCGAGATGAACGA i 3 (3-GGGACAGCAGGGTTTCTATG; reduktaza glutationowa, 5 (3-GTAGGAAGCCACACACAACT i 3 (3 -ATCTCATCACAGCCAATCCC; i ciężki łańcuch ferrytyny, 5 (3 -TGAAGCCTTAGGGCAGTACGACT i 3 (3 -TTATGGCTCGGCATCT-TGTGAACT. Warunki RT-PCR były identyczne dla wszystkich zestawów starterów: temperatura początkowa 50 ° C przez 30 minut, a następnie 35 cykli minuta w 95 ° C, minuta w 50 ° C i minuta w 68 ° C. Prążki izolowano z 1,2% żeli agarozowych (Geneclean Kit, Bio 101 Inc., La Jolla, Kalifornia, USA). Warunki PCR były identyczne dla wszystkich zestawów starterów: 10 minut w 95 ° C, następnie 35 cykli minuta w 95 ° C, minuta w 50 ° C i minuta w 68 ° C. Sondy znakowano losowo za pomocą znakowania heksamerem, a oznaczanie ilościowe określonych pasm przeprowadzono densytometrycznie (65-700 Densytometr obrazowania, Bio-Rad Life Science Research Group) przy użyciu oprogramowania Molecular Analyst 1.3 (Bio-Rad Life Science Research Group). Poziomy mRNA znormalizowano do GAPDH. Analiza zmian miażdżycowych. Wielkość uszkodzeń została określona ilościowo w zatoce aorty, jak opisano (33). W skrócie, górne sekcje serc inkubowano przez noc w utrwalaczu metylu Carnoya i parafinę zatopiono następnego dnia. Każdy kolejny odcinek (10 .m grubości) w zatoce aortalnej (400 .m) został pobrany do analizy
[podobne: rozpiska ćwiczeń na siłowni, mały weterynarz, nfz warszawa leczenie uzdrowiskowe ]
[przypisy: jak oduczyć psa skakania po ludziach, masc ochronna z wit a, tormed lubliniec ]