Przeciążenie żelazem zmniejsza miażdżycę u myszy z niedoborem apoE ad

Pokarm został usunięty z myszy na 4 godziny przed pobraniem krwi ze splotu oczodołu. Surowicę przechowywano w temperaturze ~ 70 ° C do czasu analizy. Myszy zabijano przez przemieszczenie kręgów szyjnych, a całe zwierzęta perfundowano 10 ml buforu przeciwutleniającego (100 .M dietylenotriaminopentaoctowego [DTPA], 100 .M butylowanego hydroksytoluenu [BHT], 0,1% etanolu, w PBS, pH 7,4) przez lewa komora. Tkanki szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze około 70 ° C. Tkanki stosowane do oznaczania poziomu orto-tyrozyny i dityrozyny zamrożono w buforze przeciwutleniającym. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Używania na Uniwersytecie w Waszyngtonie zatwierdził to badanie. Diety. Myszy karmiono granulowaną karmą dla gryzoni (Wayne Rodent BLOX 8604, Harlan Teklad Laboratory, Madison, Wisconsin, USA) przez 2 tygodnie przed rozpoczęciem karmienia dietą o niskiej i wysokiej zawartości żelaza. Dieta o niskiej zawartości żelaza zawierała wagowo około 0,001% BHT, 24% białka, 4,5% włókna surowego i 0,02% żelaza (szacunki producenta). Wayne Rodent BLOX 8604 w postaci niepeletowanej zmieszano (wt / wt) z żelazem karbonylowym (klasa S-3700, ISP Technologies Inc., Wayne, New Jersey, USA), uzyskując dietę wysokowartościową (2% wagowo żelaza, Teklad Test Diet nr 91091), również zawierającą 0,001% BHT (25). Diety przechowywano w temperaturze 4 ° C. Równa liczba myszy była karmiona dietami o niskiej i wysokiej zawartości żelaza dla 6 (n = 10 każdej diety), 12 (n = 10) i 24 tygodni (n = 20). FPLC. Lipoproteiny surowicy oddzielono za pomocą chromatografii wykluczania wielkości FPLC z użyciem kolumny Superose 6 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja). Surowicę (100 ul) wprowadzono na kolumnę i eluowano PBS z szybkością przepływu 0,2 ml / min w 4 ° C. Sześćdziesiąt frakcji po 500 ul zebrano przy użyciu kolektora frakcji Frac 100 (Pharmacia LKB Biotechnology). Do oznaczenia całkowitego cholesterolu użyto 100 .l każdej frakcji. Analiza Western blot. Białko ferrytynowe oznaczano ilościowo za pomocą immunoblottingu. Tkanki wątroby i aorty zostały zhomogenizowane bezpośrednio w odczynniku izolującym odtrącenie (nr katalogowy 1667, Roche Molecular Biochemicals Inc., Indianapolis, Indiana, USA). Próbki 50. G białka z wątroby, 5. G białka z tkanki aorty lub 10. L surowicy przygotowano z myszy karmionych dietami o niskiej lub wysokiej zawartości żelaza przez 24 tygodnie. Próbki poddano SDS-PAGE i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire, USA). Błony inkubowano z poliklonalnym Ab wytworzonym w króliczym łańcuchu ciężkim anty-ludzką ferrytynę (rozcieńczenie 1: 5000, Roche Molecular Biochemicals Inc.), a następnie inkubowano z jodowanym białkiem A (nr katalogowy NE146L, NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA). Krzywe standardowe przygotowano stosując ferrytynę śledziony koni typu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Ilościowe określenie intensywności pasm określono przy użyciu systemu do analizy fosforylacji cyklonu (Packard Instrument Co., Meriden, Connecticut, USA). Lipidy w surowicy. Poziomy cholesterolu w surowicy określano za pomocą zestawu kolorymetrycznego (Diagnostic Chemicals Ltd., Oxford, Connecticut, USA) ze standardami cholesterolu (Preciset nr 12552, Roche Molecular Biochemicals Inc.). Poziomy triglicerydów w osoczu określono kolorymetrycznie po usunięciu wolnego glicerolu (zestaw diagnostyczny nr 450032, Roche Molecular Biochemicals Inc.). Status żelaza. Stężenie żelaza w surowicy i całkowitą zdolność wiązania żelaza (TIBC) określono elektrochemicznie zgodnie z opisem (25) przy użyciu analizatora Ferrochem II Serum Iron / TIBC (Environmental Sciences Associates, Bedford, Massachusetts, USA) lub kolorymetrycznie (Wako Fe B i Zestawy UIBC; Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japonia). Stężenia żelaza w tkankach określono zgodnie z opisem (25). Analiza spektrometryczna mas. Tkanka wątrobowa była dializowana, pozbawiona lipidów i hydrolizowana kwasem, jak opisano wcześniej (28). Aminokwasy wyodrębniono drogą ekstrakcji w fazie stałej na kolumnie C18, przekształcono w ich pochodne kwasu n-propylo-heptafluorobutyrylowego, a następnie określono ilościowo stosując chromatografię gazową z pochłanianiem izotopów z ujemnym jonem i spektrometrią masową (GC / MS) z Hewlett Packard 5890 chromatograf gazowy sprzężony ze spektrometrem mas Hewlett Packard 5988A o rozszerzonym zakresie masy (J & W Scientific Folsom, Connecticut) (28). W tych warunkach chromatografii autentyczne związki i standardy znakowane izotopowo były rozdzielane linią podstawową i wykazywały czasy retencji identyczne z analitami pochodzącymi z próbek tkanek.
[podobne: mały weterynarz, przychodnia góra kalwaria, koktajl spalający tłuszcz ]
[więcej w: jak oduczyć psa skakania, flucontrol max, bioxetin opinie ]