Leptyna wspomaga ponowną epitelializację rany i stanowi bezpośrednią funkcję leptyny w naprawie skóry cd

Test ten określa liczbę żywotnych komórek w testach proliferacji, ponieważ całkowita ilość utworzonego formazanowego produktu końcowego jest wprost proporcjonalna do liczby żywych komórek w kulturze. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Keratynocyty HaCaT (DMEM / 10% FCS) lub ludzkie pierwotne keratynocyty (KBM-2) hodowano do 70% konfluencji i uśmiercano przez 24-godzinne głodzenie w pozbawionym surowicy DMEM (dla HaCaT) lub pozbawionym EGF KBM-2 ( dla komórek pierwotnych). Następnie komórki stymulowano 100 ng / ml ludzkiej rekombinowanej leptyny lub 10 ng / ml EGF. Po 10, 15, 20 lub 30 minutach inkubacji komórki zebrano do przygotowania ekstraktów jądrowych (26). Reakcje wiązania prowadzono przez 3 godziny na lodzie stosując 10 .g białka jądrowego w 20 .l 4% Ficollu, 20 mM HEPES, pH 7,9, 50 mM KCl, mM EDTA, mM DTT, mM PMSF, .M. g poli dI / dC i 20 000 cpm wyznakowanego 32P wiązania konsensusowego STAT3 oligo. Kompleksy DNA-białko oddzielono od wolnej sondy DNA za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (4,5%). Konkursowe eksperymenty przeprowadzono przez koinkubację odpowiednio 10. 100-krotnego nadmiaru nieznakowanego oligonukleotydowego konformusu oligonukleotydowego STAT3 dzikiego typu lub zmutowanego. Dzikie i zmutowane konsensusowe oligonukleotydy STAT3 pochodziły z testu ELISA Santa Cruz Biotechnology Inc. Całkowite białko (50 .g rozcieńczone w buforze do lizy do końcowej objętości 50 .l) z nieuszkodzonych lizatów skóry i lizatów rany, analizowano następnie pod kątem obecności immunoreaktywnego białka leptyny za pomocą ELISA przy użyciu zestawu leptyny mysi Quantikine (R & D Systems ), zgodnie z opisem producenta. Analiza statystyczna. Dane przedstawiono jako średnie plus lub minus SD. Dane analizowano za pomocą niesparowanego testu Studenta na danych surowych za pomocą Sigma Plot (Jandel Scientific, Erkrath, Niemcy). Wyniki Zastosowane lokalnie i miejscowo stosowanie leptyny hamowało gojenie się ran u myszy ob / ob. Aby określić możliwą funkcję leptyny do gojenia ran skóry, zbadano wpływ leptyny układowej i miejscowej na proces gojenia z wykorzystaniem modelu wycięcia skóry wycinków u myszy ob / ob pozbawionych leptyny. Myszy ob / ob, którym podawano dootrzewnowo leptynę (5 ug / g masy ciała, raz dziennie) charakteryzowały się znacznie przyspieszonym procesem gojenia się ran, w porównaniu z myszami kontrolnymi traktowanymi PBS. Podczas gdy rany u myszy ob / ob leczonych leptyną były całkowicie ponownie nabłonkowane w ciągu 13 dni, rany myszy kontrolnych leczonych PBS były nadal pokryte parchem, a nie nabłonkiem w 13 dni po zranieniu (Figura 1c). Histologia wykazała, że rany wyizolowane od myszy leczonych leptyną były pokryte dobrze zorganizowanym nabłonkiem, podczas gdy ponowne uśpienie rany u zwierząt kontrolnych traktowanych PBS było znacznie opóźnione. Poza tymi działaniami, leptyna zmniejszała masę ciała i poziom glukozy we krwi u zwierząt (Figura 1a), wyraźnie wskazując, że zrekombinowane białko leptyny myszy pozostawało aktywne biologicznie po podaniu ogólnoustrojowym. Ponieważ ogólnoustrojowa suplementacja leptyny u myszy ob / ob wyraźnie odwróciła fenotyp cukrzycy zwierząt, musieliśmy ocenić możliwość, że przyspieszona ponowna epitelizacja u myszy leczonych leptyną była po prostu spowodowana raczej polepszeniem fenotypu cukrzycowego niż bezpośrednim mitogenem. wpływ leptyny na nabłonek. W tym celu zbadaliśmy wpływ miejscowo stosowanej leptyny na proces gojenia ran. W tym celu do ran myszy ob / ob dodano .g leptyny w 20 .l PBS na ranę dwa razy dziennie. Zwierzęta traktowane PBS stosowano jako kontrolę. Warto zauważyć, że najmniejsze ilości miejscowo stosowanej leptyny (1 .g / rana / dzień) okazały się być silnym stymulatorem naprawy. Jak pokazano na Figurze 1d, miejscowo stosowana leptyna znacznie polepszyła naprawę rany, ponieważ rany tych myszy całkowicie ponownie nabłonkały w dniu 10 po zranieniu, podczas gdy rany zwierząt kontrolnych traktowanych PBS były wciąż pokryte parchem w tym czasie eksperymentu. punkt. Co więcej, zaobserwowaliśmy takie samo lecznicze działanie leptyny u zwierząt, gdzie rany zlokalizowane po lewej stronie grzbietu były leczone miejscowo leptyną (1 .g / rana / dzień), podczas gdy rany prawej strony przyjmowały tylko roztwór rozczynnika. Zostało to wykazane na rys. 2, ai d. Po 10 dniach stosowania leptyny lewostronne rany, które otrzymały leczenie leptyną, charakteryzowały się wysoce zorganizowanym nabłonkiem pokrywającym cały zraniony obszar (ryc. 2a). W przeciwieństwie do tego, rany znajdujące się po prawej stronie tych samych zwierząt (traktowane jedynie nośnikiem PBS, Figura 2d) nie były ponownie nabłonkowane, ponieważ migrujące języki nabłonkowe nie spotkały się, aby zamknąć ranę.
[patrz też: jak oduczyć psa skakania na ludzi, refluks u dziecka objawy, krem ziaja liście manuka ]
[patrz też: aceklofenak, otifree, mały weterynarz ]