Leptyna wspomaga ponowną epitelializację rany i stanowi bezpośrednią funkcję leptyny w naprawie skóry ad

Rany myszy typu dzikiego (Balb / c) otrzymywały 5 .g leptyny w 20 .l PBS dwa razy dziennie (8 rano, 8 wieczorem). Myszy kontrolne traktowano samym PBS. Rany z. Zmieszane. myszy leczono miejscowo leptyną po lewej stronie pleców i samym PBS po prawej stronie grzbietów. Mysie zrekombinowane leptyny pochodziły z R & D Systems (Wiesbaden, Niemcy). Zranienie i przygotowanie tkanek z rany. Aby zbadać funkcje leptyny w procesie gojenia ran, u każdego zwierzęcia uzyskano sześć ran pełnej grubości, a próbki biopsji skóry od czterech zwierząt uzyskano 1, 3, 5, 7 i 13 dni po urazie, jak opisano ostatnio (21 ). W przypadku myszy ob / ob traktowanych leptyną lub PBS określano masę ciała i poziomy glukozy we krwi (czujnik Accutrenda, Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy). Dla każdego doświadczalnego punktu czasowego, rany od trzech zwierząt i nienaruszoną tylną skórę od trzech zwierząt połączono i zastosowano do RNA (n = 9 ran) i izolacji białka (n = 6 ran), odpowiednio. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i za zgodą lokalnego rządu Hesji w Niemczech. Izolacja RNA i analiza ochrony przed RNazą. Izolację RNA przeprowadzono zgodnie z opisem (22). Dwadzieścia mikrogramów całkowitego RNA ze zranionej lub nienaruszonej skóry zastosowano do testów ochrony przed RNazą. Testy ochrony przed RNazą przeprowadzono jak opisano uprzednio (23), z co najmniej dwoma różnymi zestawami RNA z niezależnych eksperymentów gojenia ran. Fragment 366-bp odpowiadający nukleotydom 506. 871 mysiego cDNA receptora leptyny ObRb (24) zastosowano jako matrycę. RNazy A i T1 pochodziły z Roche Biochemicals (Mannheim, Niemcy). Analiza Western blot. Lizaty skóry przygotowano jak opisano wcześniej (21). Całkowite białko (50 .g) z odwiniętej skóry tylnej i 1-dniowe, 3-dniowe, 5-dniowe, 7-dniowe i 13-dniowe rany myszy typu dzikiego (Balb / c) lub myszy ob / ob traktowanych PBS lub leptynę rozdzielano stosując elektroforezę żelową SDS. Po przeniesieniu na błonę PVDF wykryto białka swoiste dla receptorów leptyny ObRa- i ObRb przy użyciu poliklonalnej surowicy odpornościowej skierowanej przeciwko syntetycznemu peptydowi, którego sekwencja pochodzi z aminokwasów 577-594 mysiego receptora leptyny (ABR, Golden, Colorado, USA ). Do wizualizacji białka receptora leptyny użyto drugorzędowego Ab sprzężonego z peroksydazą chrzanową (Biomol, Hamburg, Niemcy) i ulepszonego systemu wykrywania chemiluminescencyjnego (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Niemcy). Analiza histologiczna. Myszy zraniono jak opisano powyżej. W dniach 3, 5, 7 i 13 po zranieniu myszy uśmiercono, a kompletne rany wyizolowano ze środka grzbietu, podzielono na pół i zamrożono w podłożu do zamrażania tkanek. Immunohistochemię przeprowadzono na 6- um zamrożonych skrawkach, jak opisano wcześniej (21). Skrawki następnie inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej z poliklonalną surowicą odpornościową rozpoznającą postać ObRa i ObRb mysiego receptora leptyny (ABR), poliklonalnego Ab skierowanego przeciwko COOH-końca mysiego podtypu receptora leptyny ObRb (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Niemcy) lub poliklonalną surowicę odpornościową skierowaną przeciwko mysiemu Ki67 (Dianova, Hamburg, Niemcy) rozcieńczoną 1: 100 w PBS, 0,1% BSA. Hodowla komórek pierwotnych ludzkich keratynocytów. Ludzkie pierwotne naskórkowe keratynocyty zakupiono od BioWhittaker Europe Inc. (Verviers, Belgia). Komórki hodowano w określonej pożywce keratynocytowej (KBM-2) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Test 5-bromo-2 (3-deoksyurydyny. Keratynocyty (linia komórkowa HaCaT [25] i ludzkie pierwotne komórki) zaszczepiono na 96-studzienkowych płytkach w stężeniu 5 x 102 komórek na studzienkę. Po 24 godzinach inkubacji komórki stymulowano następnie leptyną (0,1. 500 ng / ml), EGF (10 ng / ml), KGF (10 ng / ml) lub kombinacją czynników wzrostu przez dodatkowe 24 godziny. Po inkubacji z czynnikiem wzrostu dodano odczynnik znakujący 5-bromo-2 (3-deoksyurydynę (BrdU) (Roche Biochemicals) w celu dodatkowej 1-godzinnej inkubacji. Włączenie BrdU podczas fazy komórkowej S, jak oceniono za pomocą testu ELISA z kolorymetrycznym rozmnażaniem BrdU (Roche Biochemicals) zastosowano jako bezpośredni odczyt szybkości proliferacji komórek. Ludzką rekombinowaną leptynę zakupiono od R & D Systems, a EGF i KGF pochodziły od Roche Biochemicals. Test proliferacji. Keratynocyty (linia komórkowa HaCaT i ludzkie komórki pierwotne) zaszczepiono na 96-studzienkowych płytkach. Każda studzienka zawierała 103 komórek w całkowitej objętości 100 ul DMEM / 10% FCS (dla HaCaT) lub KBM-2 (dla komórek pierwotnych). Następnie komórki hodowano przez 24 godziny. Szybkość proliferacji inkubowanych komórek została określona po 24-godzinnej stymulacji leptyną (100 ng / ml), KGF (10 ng / ml), EGF (10 ng / ml) lub kombinacją czynników wzrostu za pomocą CellTiter 96 Oznaczenie proliferacji komórek w jednym roztworze wodnym (Promega, Mannheim, Niemcy), zgodnie z instrukcjami producenta
[patrz też: linka treningowa dla psa, nfz warszawa leczenie uzdrowiskowe, aglan cena ]
[hasła pokrewne: aglan cena, afobam działanie, damar ruda śląska ]