Leptyna wspomaga ponowną epitelializację rany i stanowi bezpośrednią funkcję leptyny w naprawie skóry ad 7

Wpływ leptyny (100 ng / ml), KGF (10 ng / ml) lub EGF (10 ng / ml) na prążki HaCaT (otwarte słupki) i pierwotną (wypełnione słupki) proliferację keratynocytów. KGF i leptyna lub EGF i leptyna były również podawane jednocześnie, jak wskazano. Proliferację określono przez inkorporację BrdU (lewy panel) lub z użyciem odczynnika MTS (prawy panel), jak opisano w Metodach. Dane wyrażono jako procent niestymulowanej kontroli. Średni procent zmiany proliferacji. Przedstawiono SD (wartości reprezentują średnią z sześciu testów z odczytem dziewięciu studzienek dla każdego warunku, n = 54). AP <0,01 w porównaniu z kontrolą. (d i e) EMSA. Keratynocyty HaCaT (d) i pierwotne keratynocyty (e) hodowano do konfluencji i uśmiercano przez 24-godzinną inkubację w pożywce bez surowicy. Komórki następnie stymulowano leptyną (100 ng / ml) lub EGF (10 ng / ml) we wskazanych okresach czasu. Ekstrakty jądrowe stymulowanych komórek izolowano zgodnie z opisem w Metodach. Swoistość wiązania potwierdzono w doświadczeniach z konkurencją z użyciem 10-100-krotnego nadmiaru nieznakowanego, dzikiego typu (STAT3wag) lub zmutowanego oligonukleotydu koniugującego STAT3 (STAT3 mut), jak wskazano. Lep, leptyna; KC, keratynocyt. Proliferacja wzmocniona leptyną i aktywowany STAT3 w ludzkiej linii komórkowej keratynocytów HaCaT i ludzkich pierwotnych keratynocytach. Aby dodatkowo wzmocnić obserwacje in vivo, określiliśmy mitogenną moc leptyny w keratynocytach in vitro. Najpierw, przez amplifikację RT-PCR, a następnie klonowanie i sekwencjonowanie zamplifikowanych fragmentów cDNA, oceniano, że ludzka linia komórkowa keratynocytów HaCaT (25) oraz, dodatkowo, pierwotne ludzkie keratynocyty rzeczywiście eksprymowały wariant splicingu ObRb, co sugeruje, że komórki są wrażliwe. do sygnalizacji za pośrednictwem leptyny (dane nie pokazane). Przy użyciu testu ELISA na proliferację komórek BrdU, zaobserwowaliśmy silne i zależne od dawki działanie proliferacyjne rekombinowanej ludzkiej leptyny na linię komórkową HaCaT (Figura 5b, zacienione słupki) i ludzkie pierwotne keratynocyty (Figura 5b, wypełnione słupki). Co godne uwagi, efekty mitogenne można było zaobserwować nawet przy najniższym stężeniu leptyny (0,1 ng / ml). Należy zauważyć, że pożywka stosowana do hodowli ludzkich pierwotnych keratynocytów (KBM-2, patrz Metody) obejmowała epinefrynę (0,5 .g / ml), o której wiadomo, że zwiększa aktywność cyklazy adenylanowej (28), a następnie stężenia cAMP (29) w keratynocytach. Proporporacyjny wpływ leptyny był porównywalny z efektem obserwowanym przez dobrze znane mitogeny nabłonkowe EGF i KGF (Figura 5c, lewy panel). Ponadto, wyniki te potwierdzono za pomocą testu MTS (Figura 5c, prawy panel), który reprezentuje kolorymetryczną metodę określania liczby żywotnych komórek w testach proliferacji. Dodatkowo, mitogenne działanie leptyny obserwowane w ludzkiej linii komórek keratynocytów i ludzkich pierwotnych keratynocytach można było zaobserwować w mysich pierwotnych keratynocytach (dane nie pokazane). Wyniki te wskazują na mechanizm sygnalizacyjny w keratynocytach, który może reagować na bodziec, w którym pośredniczy leptyna. Ponieważ opisano, że wiązanie leptyny z jej receptorem aktywuje kinazy tyrozynowe, które następnie fosforylują STAT (5), badaliśmy, czy podobny szlak transdukcji sygnału działa w keratynocytach. Dlatego określiliśmy siłę leptyny do aktywacji czynnika transkrypcyjnego STAT3 w linii komórkowej keratynocytów HaCaT (Figura 5d) i pierwotnych keratynocytach (Figura 5e), odpowiednio, ponieważ translokację jądra STAT3 opisano jako wynik aktywacji receptora ObRb. w podwzgórzu lub komórkach śródbłonka (4, 17). Korzystając z techniki zmiany ruchów elektroforetycznych (EMSA), zaobserwowaliśmy szybki i silny wzrost aktywowanego STAT3 w ciągu 15 minut stymulacji leptyną. Aktywację STAT3 za pośrednictwem EGF zastosowano jako kontrolę pozytywną (30), a specyficzność kompleksu STAT3 potwierdzono w doświadczeniach kompetycyjnych, stosując odpowiednio zmutowane lub dzikiego typu konsensusowe oligonukleotydy STAT3 (Figura 5, d i e). Omówienie Przez wiele lat myszy ob / ob stosowano jako modelowy system do upośledzonego gojenia się rany, a dodatkowo zaobserwowane zaburzenia gojenia się ran wyjaśniono fenotypem cukrzycowym tych zwierząt (31). Jednak dobrze wiadomo, że tło genetyczne C57 / BL6J powoduje umiarkowany fenotyp cukrzycy, występujący tylko przejściowo i głównie we wczesnych stadiach rozwojowych (32), co wskazuje, że umiarkowana hiperglikemia może nie stanowić jedynego powodu upośledzonego gojenia się rany obserwowano u zwierząt z niedoborem leptyny. Niniejsze badanie pokazuje, że upośledzona naprawa u myszy ob / ob może wynikać z braku leptyny działającej jako czynnik mitogenny dla keratynocytów w miejscu rany [patrz też: przyczyny suchego kaszlu, krem ziaja liście manuka, linka treningowa dla psa ] [patrz też: masc ochronna z wit a, tormed lubliniec, laremid ulotka ]