Humanizowany model doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka u myszy transgenicznych HLA klasy II czesc 4

Wyniki przedstawiono jako wskaźniki stymulacji, obliczone jako średnie cpm hodowlanych w trzech powtórzeniach z antygenem, podzielone przez średnią cpm hodowli w trzech powtórzeniach z pożywką,. SE. Element restrykcyjny zaangażowany w prezentację antygenu oceniano za pomocą testów blokowania przeciwciał przy użyciu oczyszczonych przeciwciał przeciwko DR (klon L243), DQ (klon Tü 39 lub Tü 169), IA (klon AF6-120.1) lub IE (klon 14-4-4S ) (BD Pharmingen). Przeciwciała dodano w stężeniu 10 .g / ml do dołków zawierających komórki w obecności lub pod nieobecność odpowiedniego stymulującego antygenu. Hodowle inkubowano przez 60 godzin i pulsowano 3H tymidyną (1,0 Ci / 10 ul / studzienkę) przez ostatnie 18 godzin. Mapowanie epitopów komórek T. Zastosowano peptydy o dwudziesto-resztowej sekwencji zachodzące na 10 reszt i reprezentujące liniową sekwencję pierwszej powtórzenia hIRBP lub całej sekwencji cząsteczki hS-Ag (30) (AnaSpec Inc.). HLA-DQ8 TG, HLA-DR3 TG lub myszy C57BL / 6 typu dzikiego (H2b) immunizowano odpowiednio schematem uveitogenic IRBP lub S-Ag. Śledziony zebrano w dniu 10 po immunizacji i zebrano od kilku myszy w każdej grupie. Komórki testowano w standardowym teście proliferacji, jak opisano powyżej, przeciw stężeniu 10 .M peptydów pochodzących z immunizującego antygenu. Określone liczby (. Cpm) obliczono po odjęciu cpm tła. Oznaczanie zawartości limfokin w supernatantach hodowli i przeciwciałach w surowicy odpornościowej za pomocą testu ELISA. Cytokiny oznaczano w supernatantach komórek węzłów chłonnych zebranych w dniu 14 po immunizacji i hodowano z optymalnym stężeniem immunizującego antygenu, jak w przypadku powyższych testów proliferacji. Supernatanty zebrano po 48 godzinach. Obecność IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-a i TNF-a w supernatancie stymulowanych komórek mierzono za pomocą multipleksowej ELISA przy użyciu technologii Pierce SearchLight (Pierce Boston Technology, Woburn, Massachusetts, USA) (34) (http://www.searchlightonline.com). Przeciwciała surowicy badano na płytkach opłaszczonych IRBP lub S-Ag (5 ug / 100 ul / studzienkę) z użyciem koziego przeciwciała przeciw mysiej IgG znakowanego HRP (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, Kalifornia, USA) jako rozwijającego się przeciwciała. i substrat 3,3 ^ 5,5-tetrametylobenzydyny (100 ul / studzienkę; Endogen Inc., Woburn, Massachusetts, USA). Analiza statystyczna. Istotność statystyczną różnic w wynikach choroby obliczono za pomocą testu Snedecora i Cochrana (35) dla trendu liniowego w proporcjach, przy czym każda mysz (średnia obu oczu) jako jedno zdarzenie statystyczne. Jest to test nieparametryczny, który generuje wartości P według analizy częstotliwościowej liczby osobników przy każdym możliwym wyniku, biorąc pod uwagę zarówno ciężkość jak i częstość występowania choroby. Dane o opóźnionej nadwrażliwości i proliferacji limfocytów analizowano przy użyciu niezależnego testu t. Wartości prawdopodobieństwa P. 0,05 uznano za znaczące. Wyniki. Myszy HLA TG są podatne na zapalenie naczyniówki wywołane IRBP. Myszy HLA TG immunizowano protokołem naczyniotwórczym IRBP i oczy zbierano do histopatologii 21. 28 dni po immunizacji. Typową EAU indukowano we wszystkich szczepach HLA TG. Histopatologia (ryc. 1, b i c) była rażąco podobna do obserwowanej u myszy typu dzikiego na tle C57BL / 10, wykazując naciek komórek jednojądrzastych i komórek polimorfojądrowych, zapalenie witaminy, zapalenie naczyniówki i różne stopnie uszkodzenia komórek fotoreceptorów. Nasilenie choroby u poszczególnych myszy wahało się od 0,5 do 3, a częstość występowania wynosiła około 80% (Figura 2). Wyniki te nie różniły się od częstości występowania i ciężkości obserwowanych u szczepów kontrolnych. Myszy A0, które nie eksprymują żadnych cząsteczek MHC klasy II, lecz eksprymują mysie cząsteczki klasy I, miały niewielką lub żadną chorobę, z tylko jedną myszką z 11 wykazującą śladową infiltrację w jednym oku, najprawdopodobniej reprezentującą łagodny spontaniczny stan zapalny niezwiązany z eksperymentalne manipulacje. Nie preferujemy możliwości, że reprezentuje to prezentację IRBP przez szlak klasy I, ponieważ myszy te miały nieznaczną swoistą reakcję nadwrażliwości typu IRBP opóźnionego typu i odpowiedzi proliferacyjnej (dane nie pokazane), co sugeruje, że przy braku klasy II immunizacja IRBP nie udaje się aby uzyskać znaczącą odpowiedź. Figura 1Histopatologiczne cechy EAU u myszy HLA TG. (a) Normalne oko. Warstwy siatkówki są uporządkowane i dobrze zachowane. (b) Ocena choroby 2 u myszy C57BL / 10 immunizowanych IRBP. Struktura siatkówki jest zdezorganizowana, obecna jest infiltracja komórek zapalnych, a warstwa fotoreceptorów jest uszkodzona. (c) Wynik 3 dla choroby w myszach DR4 TG immunizowanych IRBP. Należy zwrócić uwagę na znaczne zniszczenie warstwy komórek fotoreceptorów
[podobne: filet z łososia na patelni, usg stawów biodrowych u niemowląt kraków, najśmieszniejsze nazwiska w polsce ]
[podobne: aglan cena, afobam działanie, damar ruda śląska ]