Humanizowany model doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka u myszy transgenicznych HLA klasy II cd

S-Ag oczyszczono metodą Buczylko i Palczewskiego (27) z modyfikacjami opisanymi przez Puig i in. (28). Końcową elucję z kolumny z heparyną-agarozą przeprowadzono przez gradient od 10 mM HEPES i 15 mM NaCl, pH 7,0, do 10 mM HEPES i 400 mM NaCl, pH 7,0. Oczyszczone bS-Ag połączono w pulę w oparciu o OD 278 nm. Przygotowanie rekombinowanej ludzkiej S-Ag (hS-Ag) opisano wcześniej (29). Toksynę krztuścową i CFA zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Szczep Mycobacterium tuberculosis H37RA zakupiono od Difco Laboratories (Detroit, Michigan, USA). Zsyntetyzowano dwadzieścia-resztkowe peptydy zachodzące na dziesięć reszt i obejmujące pierwszą homologiczną powtórzeń ludzkiego IRBP (hIRBP) (35 kDa) (30) i całą hS-Ag (48 kDa, AnaSpec Inc., San Jose, Kalifornia, USA). konwencjonalnymi technikami w fazie stałej, jak opisano (30, 31). Indukcja i punktacja EAU. Indukcję EAU i punktację przeprowadzono na dwa sposoby: przez czynną immunizację i przez adoptywny transfer. W celu aktywnej immunizacji myszy wstrzyknięto podskórnie 200 .l bIRBP, bS-Ag lub zrekombinowanego hS-Ag zemulgowanego (1: 1, objętościowo) z CFA (Sigma-Aldrich), który został uzupełniony szczepem M. tuberculosis. H37RA (Difco Laboratories) do końcowego stężenia 2,5 mg / ml. Równolegle z immunizacją, wstrzyknięto dootrzewnowo 0,2. G toksyny krztuśca. Oczy od myszy immunizowanych IRBP zebrano 21. 28 dni po immunizacji, a oczy od zwierząt immunizowanych S-Ag. Zebrano po 28. 35 dniach. Oczy utrwalano przez godzinę w 4% buforowanym fosforanami aldehydem glutarowym i przenoszono do 10% fosforanu buforowanego formaldehydem. Naprawiono i odwodniono tkankę w metakrylan. Skrawki (4. 6 (im) pocięto przez źrenicową płaszczyznę nerwu wzrokowego, a następnie wybarwiono standardowym H & E. Ocena ilościowa choroby została przeprowadzona w zamaskowany sposób z wykorzystaniem opisanych wcześniej kryteriów (32). Krótko mówiąc, oczom przypisano wynik w zakresie od 0 do 4, w zależności od stopnia zapalenia i uszkodzenia tkanki. Minimalne kryterium oceny wyniku histopatologicznego jako pozytywnego to infiltracja komórek zapalnych w ciele rzęskowym, naczyniówce, ciele szklistym lub siatkówce (0,5 stopnia EAU). Stopniowo wyższe oceny przypisano do obecności dyskretnych zmian w tkance, takich jak zapalenie naczyń, tworzenie ziarniaków, fałdowanie siatkówki i / lub odrywanie i uszkodzenie fotoreceptorów. Maksymalny stopień 4 odzwierciedla rozległe uszkodzenie siatkówki z całkowitym zniszczeniem warstwy komórek fotoreceptorów. W celu indukcji EAU przez adoptywne przeniesienie, myszy HLA-DQ8 i HLA-DQ6 immunizowano za pomocą IRBP, a myszy HLA-DR3 immunizowano S-Ag, stosując opisany powyżej protokół naczyniotwórczy. W 14 dniu po immunizacji zbierano surowicę odpornościową, miareczkowano na zawartość przeciwciał metodą ELISA i przechowywano w temperaturze 4 ° C do infuzji do naiwnych biorców. Węzeł chłonny i komórki śledziony zebrano w grupie i hodowano przez 3 dni, jak opisano uprzednio (33) przy optymalnym stężeniu immunizującego antygenu (30 ug / ml IRBP lub 10 ug / ml S-Ag) i 5 ng. / ml rekombinowanej IL-12. Naiwne myszy biorcy o odpowiednim genotypie infuzowano dootrzewnowo 60 x 106 do 100 x 106 hodowanych komórek. Jeden mililitr surowicy odpornościowej wstrzyknięto dożylnie w postaci dwóch dawek 0,5 ml podanych jednocześnie z komórkami i 48 godzin później. Rozwój choroby oceniano metodą fundoskopii i oceniano w skali 0. 4, jak opisano wcześniej (32). EAU zostało potwierdzone przez histopatologię w oczach zebranych po 16. 18 dniach. Reakcje nadwrażliwości typu opóźnionego. Dwa dni przed zakończeniem eksperymentu myszy otrzymały 10 .l odpowiedniego antygenu w objętości 10 .l śródskórnie do małżowiny usznej jednego ucha. Drugiemu uchu wstrzyknięto PBS. Obrzęk ucha zmierzono 48 godzin później za pomocą sprężynowego mikrometru. Test proliferacji limfocytów i blokowanie przeciwciał. Węzły chłonne drenujące miejsce immunizacji (pachwinowe i biodrowe) zebrano po zakończeniu każdego doświadczenia i zebrano w każdej grupie. Trzykrotne 0,2-ml kultury zawierające 5 x 105 komórek / studzienkę stymulowano 30 .g IRBP lub 20 .g S-Ag w 96-dołkowych okrągłodennych płytkach w RPMI 1640 (BioWhittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA). suplementowany jak opisano i zawierający 1% surowicę mysią (32). Do proliferacji do bIRBP włączono 20 mg / ml p-metylopiranopiranozydu (Sigma-Aldrich) w celu zneutralizowania wszelkich możliwych śladów ConA, które mogą ługować z kolumny stosowanej w początkowych etapach oczyszczania IRBP. To stężenie a-metylo-mannopiranozydu nie miało niekorzystnego wpływu na proliferację komórek
[hasła pokrewne: przeglądarka skierowań sanatoryjnych nfz, filet z łososia na patelni, krem ziaja liście manuka ]
[hasła pokrewne: tabcin ulotka, chitinin extra, kolmed międzylesie ]