Glioksalaza 1 zwiększa lęk poprzez redukcję agonisty metyloglioksalu receptora GABAA ad

Pierwsze egzjony Dnahc8 i Btbd9 zostały usunięte przez wstawienie odpowiednio kasetek z ampicyliną (AMP) i kanamycyną (KAN). (B) Liczba kopii BAC została oszacowana przez qPCR na genomowym DNA (n = 8 WT i 3. 5 Tg na linię). P <10. 10, jednokierunkowa ANOVA. (C) mRNA Glo1 oszacowano w całym mózgu za pomocą qPCR (n = 12 WT i 4. 7 Tg na linię). P <10. 14, jednokierunkowa ANOVA. (D i E) Białko GLO1 oszacowano w całym mózgu na podstawie immunoblot (n = 16 WT i 3. 6 Tg na linię). P <10. 11, jednokierunkowa ANOVA. Dane są średnie. SEM. * P <0,05; ** P <0,0001. Następnie zmierzono ekspresję mRNA Glo1 przy użyciu qPCR. Myszy Tg wykazały zależny od liczby kopii wzrost mRNA Glo1 w mózgu (Figura 1C) i tkankach obwodowych (dodatkowa Figura 2). Podobnie, myszy Tg wykazywały zależny od liczby kopii wzrost białka GLO1 w mózgu, mierzony immunoblotem (fig. 1, D i E). Zatem BAC zależnie od dawki zwiększał mRNA Glo1 i białko u myszy Tg. Korzystając z mikromacierzy z ekspresją genu, potwierdziliśmy, że myszy Tg nadeksprymowały Glo1, ale nie zaobserwowaliśmy żadnych innych zmian w ekspresji genów (Tabela uzupełniająca 2). W szczególności nie zaobserwowaliśmy zwiększonej ekspresji Dnahc8 lub Btbd9, co potwierdza skuteczną ablację ich transkrypcji z BAC. Nadekspresja Glo1 zwiększa zachowanie lękowe. Użyliśmy samców myszy Tg do zbadania wpływu nadekspresji Glo1 na zachowanie podobne do lęku w teście na otwartym polu (OF). Test OF jest wrażliwy na środki lękowe i anksjolityczne (14) i jest powiązany z regionami mózgu i neurotransmiterami związanymi z lękiem u ludzi (15, 16). Ponadto, test OF był wrażliwy na różnicową ekspresję Glo1 w poprzednich badaniach (2, 3). Myszy Tg wykazywały znaczące, zależne od liczby kopii, zmniejszenie czasu w środku OF (określane jako czas środkowy) w porównaniu z myszami WT (Figura 2A), odzwierciedlając zwiększone zachowanie podobne do lęku (17). Myszy WT i Tg nie różniły się znacząco całkowitą odległością przebytą podczas testu (Figura 2B). Dane te dostarczają bezpośrednich dowodów na to, że GLO1 zwiększa zachowanie lękowe. Nadekspresja 2Glo1 zwiększa zachowanie lękowe. Uczestnicy z miotu WT i Tg byli testowani w teście OF (n = 74 WT [połączone przez wszystkie linie] i 14. 21 Tg na linię). (A) Czas środkowy. P <0,001, 1-drożna ANOVA. (B) Całkowita odległość. P> 0,1, jednokierunkowa ANOVA. Dane zebrano z wielu indywidualnych eksperymentów. Dane są średnie. SEM. * P <0,05. Wygenerowaliśmy 5 dodatkowych linii myszy Tg na tle FVB / NJ (FVB), aby ocenić uogólnienie wywołującego efekt lęku GLO1. Myszy FVB Tg wykazały zwiększoną liczbę kopii Glo1 (dodatkowa postać 3A) i ekspresję (dodatkowa postać 3B) w porównaniu z myszami WT. W teście OF, myszy FVB Tg wykazywały zmniejszony czas środkowy w porównaniu z myszami WT (Suplementowa Figura 3C). Wyniki te odzwierciedlają nasze odkrycia u myszy B6 Tg i pokazują, że GLO1 zwiększa zachowanie podobne do lęku na wielu podłożach genetycznych. W celu dokładniejszej oceny roli GLO1 w lęku, przetestowaliśmy myszy WT i Tg w 2 dodatkowych sprawdzonych testach zachowania lękowego, testu jasnego ciemnego (LD) (18) i podwyższonego labiryntu plus ( 19). W teście z LD, myszy Tg spędzały mniej czasu w przedziale świetlnym w porównaniu z myszami WT (Tabela dodatkowa 3). Myszy WT i Tg nie różniły się istotnie liczbą przejść między dwoma przedziałami, co wskazuje na normalną aktywność lokomotoryczną (18, 20). W podwyższonym labiryncie myszy Tg wykonały mniej wejść do otwartych ramion w porównaniu z myszami WT (Tabela dodatkowa 4). Myszy WT i Tg nie różniły się liczbą całkowitych wejść ramion, ponownie wskazując normalną aktywność lokomotoryczną. Łącznie dane te pokazują, że nadekspresja Glo1 zwiększa zachowanie podobne do lęku na różnych podłożach genetycznych i w wielu testach behawioralnych. Glo1 zwiększa lęk, zmniejszając poziomy MG. Użyliśmy linii B6 Tg z najwyższą liczbą kopii (linia B6), aby zbadać mechanizm molekularny leżący u podstaw działania lękowego GLO1. Biorąc pod uwagę znaną rolę GLO1 w oczyszczaniu MG (8), postawiliśmy hipotezę, że GLO1 zwiększa lęk poprzez regulację stężenia MG. Najpierw zmierzono metabolizm MG u myszy WT i Tg za pomocą testu aktywności enzymatycznej GLO1. Tkanka mózgowa myszy Tg metabolizowała substrat hemitioacetalowy, utworzony z MG i glutationu, szybciej niż tkanka mózgowa myszy WT (Figura 3A). Odzwierciedla to zwiększoną zdolność do oczyszczania MG. Następnie zmierzono stężenie MG w mózgach myszy WT i Tg za pomocą HPLC. Myszy Tg miały około 10% zmniejszenie stężenia MG w mózgu w porównaniu z myszami WT (Figura 3, B i C) [przypisy: przerost mięśnia sercowego, alzheimer pierwsze objawy, filet z łososia na patelni ] [patrz też: damar ruda śląska, aceklofenak, otifree ]