Droga insuliny / Akt kontroluje specyficzny program podziału komórek, który prowadzi do tworzenia dwujądrowych tetraploidalnych komórek wątroby u gryzoni. czesc 4

Cytokinezy analizowano przez potrójne znakowanie jądra komórkowego, mikrotubul i błon. Uszkodzenie cytokinezy obserwowano w 1,8%. 0,3% zdarzeń hepatocytów leczonych STZ, wartość znacznie niższa niż 20,5%. 2,7% dla hepatocytów kontrolnych (Figura 4G). Odkrycia te pokazują, że obniżenie poziomu insuliny spowodowało, że prawie wszystkie hepatocyty zaangażowały się w normalny cykl komórkowy i doprowadziły do wytworzenia diploidalnego potomstwa. Aby wzmocnić te odkrycia, przeanalizowaliśmy zmianę procesu tetraploidalnego w mysim modelu ob / ob, w którym, podobnie jak w modelu STZ, sygnalizacja insuliny jest upośledzona podczas wzrostu wątroby po urodzeniu. W modelu ob / ob insulinooporność rozpoczyna się po raz pierwszy po okresie przesiedlania i jest dobrze ustalona w wieku dorosłym (28). W 5 tygodniu po urodzeniu sygnalizacja Akt była już upośledzona w tym modelu (Figura 5A). Ponadto odsetek dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów był znacząco niższy niż u myszy kontrolnych (25,4%. 1,8%, Figura 5, B i C). Łącznie wyniki te wskazują, że upośledzenie sygnalizacji insuliny hamuje wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych przodków. Figura 4 Zmniejszony poziom insuliny znosi wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów. (A) Szczurom z tego samego miotu wstrzykiwano STZ lub nośnik, odstawiano od matki w wieku 20 dni i karmiono dietą bogatą w węglowodany. Po fazie po posiłku szczury uśmiercono po 24 dniach dla analizy in vivo (D) lub dla izolacji pierwotnych hepatocytów (E i F). (B) Stężenie insuliny we krwi i insuliny we krwi mierzono u wszystkich zwierząt po 24 dniach. Wyniki są średnie. SEM dla co najmniej 6 zwierząt na grupę. Con, kontrola. (C) Całkowity RNA ekstrahowano z kontrolnych (Con) i szczurów traktowanych STZ (n = 3), a poziomy mRNA SREBP-1c, L-PK i FAS analizowano za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wartości są znormalizowane do mRNA cyklofiliny. (D) Ekstrakty białkowe wytworzono z tkanki wątroby od kontrolnych lub traktowanych STZ szczurów i poddano immunoblottingu z przeciwciałami przeciwko prekursorowej postaci SREBP-1c, GK, FAS i fosfo-Akt (Ser473) (P-Akt). A-Tubulinę stosowano jako kontrolę obciążenia. Przedstawiono reprezentatywny Western blot. (E) Procent komórek tetraploidalnych. Histogramy pokazują. SEM z 3 niezależnych eksperymentów (n = 6 [kontrola]; 15 [STZ]). (F) Pierwotne hepatocyty izolowane od kontrolnych i traktowanych STZ szczurów były wybarwione immunologicznie dla (3-kateniny, (4-tubuliny i Hoechst w celu analizy prawidłowej cytokinezy i uszkodzenia cytokinezy. Paski skali: 10 .m. (G) Procent zdarzeń niepowodzeń cytokinzy u szczurów w F. Dla każdego warunku analizowano 100 telofaz. Wyniki są średnie. SEM (n = 2 na grupę). * P <0,05, ** P <0,01, P <0,005 względem kontroli. Ryc. 5 Proces tetraploidalny u myszy ob / ob. (A) Immunoblot z przeciwciałem przeciw fosfo-Akt (Ser473). A-Tubulinę stosowano jako kontrolę obciążenia. Przedstawiono reprezentatywny Western blot (n = 4 na grupę). (B) Sekcja tkankowa po dwukrotnym barwieniu za pomocą a-kateniny i Hoechst, ilustrująca różnicę między diploidalnym i tetraploidalnym hepatocytami u 5-tygodniowych myszy WT i ob / ob. Pasek skali: 10 .m. (C) Procent komórek tetraploidalnych u myszy WT i ob / ob (n = 4 na grupę). * P <0,05 względem WT. Następnie sprawdziliśmy, czy wzrost stężenia insuliny może sam w sobie indukować wytwarzanie dwujądrowych komórek tetraploidalnych. Ustaliliśmy zdolność proliferacyjną hepatocytów i ich reakcję na insulinę podczas wzrostu wątroby po urodzeniu, badając wskaźnik znakowania Ki67. W dniach 15-20, tuż przed odsadzeniem, proliferacja znacznie się zmniejszyła, a późniejsze przejście od karmienia do odsadzenia rozpoczynające się od dnia 20 było związane ze wzrostem wskaźnika proliferacji (Figura 6A). Ekspresja IR wzrosła szczególnie po odstawieniu, skorelowana z aktywacją genów regulowanych przez insulinę GK i fosfo-Akt (Figura 6B). W związku z tym przetestowaliśmy, czy wzrost poziomu insuliny podczas przejścia od karmienia do odsadzenia stymuluje wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych komórek wątroby. Szczurom z tego samego miotu wstrzykiwano insulinę lub jej nośnik wokół maciory (Figura 6C). U szczurów traktowanych insuliną poziom fosfo-Akt był wyższy niż u szczurów kontrolnych (Figura 6D). Co godne uwagi, odsetek hepatocytów od szczurów traktowanych insuliną, które były tetraploidalne, wynosił 32,2%. 14,6% wyższa niż u zwierząt kontrolnych (ryc. 6E). Wszystkie te obserwacje pokazują, że wytwarzane przez insulinę komórki tetraploidalne wątroby są dwujądrowe. Figura 6 Wzrost stężenia krążącego insuliny wokół odsadzenia powoduje wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych komórek wątroby [hasła pokrewne: przychodnia góra kalwaria, rozpiska ćwiczeń na siłowni, nfz warszawa leczenie uzdrowiskowe ] [podobne: bioxetin opinie, jak oduczyć psa skakania po ludziach, masc ochronna z wit a ]