Droga insuliny / Akt kontroluje specyficzny program podziału komórek, który prowadzi do tworzenia dwujądrowych tetraploidalnych komórek wątroby u gryzoni. cd

Procent dwulijądrowych komórek tetraploidów obliczono przez analizę barwienia immunologicznego a-kateniny / Hoechst. Histogramy pokazują. SEM z 3 niezależnych eksperymentów. Analizie poddano minimum 2500 hepatocytów w 8. 12 osobnych, losowo wybranych polach (n = 5 na grupę). Następnie zbadaliśmy, czy podaż odżywcza, szczególnie wzrost zawartości węglowodanów w diecie, wpłynął na wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów. Szczury z tego samego miotu karmiono przez 6 dni dietą bogatą w węglowodany, niskotłuszczową lub niskotłuszczową dietą o wysokiej zawartości tłuszczu (Figura 3A). Ponieważ długotrwała dieta wysokotłuszczowa może indukować hiperinsulinemię i hiperglikemię (26), sprawdziliśmy, czy poziom glukozy i insuliny we krwi był zmodyfikowany w naszych warunkach krótkotrwałego żywienia wysokotłuszczowego; nie zaobserwowano znaczącego wzrostu (Figura 3B). Równolegle przeanalizowano poziomy ekspresji kluczowych czynników kontrolujących szlaki glikolityczne i lipogenne, w tym SREBP-1c, glukokinazę (GK), kinazę pirogronianu wątrobowego (L-PK) i syntazę kwasu tłuszczowego (FAS) (27). W krótkoterminowym karmieniu wysokotłuszczowym dieta nie miała wpływu na ekspresję SREBP-1c i GK (Ryc. 3, C i D), co wskazuje, że szlak sygnalizacji insuliny był funkcjonalny. Odwrotnie, znaczący spadek FAS (sygnalizacja insuliny i glukozy) i ekspresja L-PK (tylko sygnalizacja glukozowa) obserwowano w grupie wysokotłuszczowej diety (Figura 3, C i D), co wskazuje, że zakłócono sygnalizację glukozy. W obu warunkach diety określiliśmy ilościowo odsetek diploidalnych i tetraploidalnych populacji hepatocytów (patrz Figura 2B) i ustaliliśmy, że różne diety nie zaburzały wytwarzania dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów (Figura 3E). Łącznie dane te wskazują, że sygnalizacja glukozy nie jest niezbędna do tetraploidyzacji w wątrobie. Ryc. 3 Wpływ spożycia węglowodanów na proces tetraploidalny. (A) Szczury z tego samego miotu zostały odstawione od matki w wieku 19 dni; połowa szczurów została przydzielona do diety wysokowęglowodanowej (HC), a druga połowa do diety wysokotłuszczowej (HF). Przed ofiarą w 25 dniu, szczury poszczono przez 24 godziny, a następnie przepisano im odpowiednią dietę na 18 godzin. (B) Stężenie insuliny we krwi i insuliny we krwi mierzono u wszystkich zwierząt przed poświęceniem. Wyniki są średnie. SEM dla co najmniej 8 zwierząt na grupę. (C) Całkowity RNA ekstrahowano z wątroby szczurów (n = 5 [wysoki węglowodan], 9 [o wysokiej zawartości tłuszczu]) i analizowano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym w celu oszacowania liczebności mRNA SREBP-1c, L-PK i FAS. Wartości są znormalizowane do wartości dla mRNA cyklofiliny, ** P <0,01. (D) Ekstrakty białkowe wytworzono z tkanki wątroby ze szczurów karmionych karmą wysokowęglowodanową lub o wysokiej zawartości tłuszczu i poddano immunoblottingowi z przeciwciałami przeciwko SREBP-1c (forma prekursorowa, pSREBP-1c), GK i białka FAS. A-Tubulinę stosowano jako kontrolę obciążenia. Przedstawiono reprezentatywny Western blot. (E) Procent dwujądrowych komórek tetraploidalnych obliczono jak opisano na Figurze 2C. Histogramy pokazują. SEM z 3 niezależnych eksperymentów (n = 14 na grupę). Stężenie insuliny reguluje wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów. Aby zmniejszyć poziom krążącej insuliny, szczury leczono przed odstawieniem streptozotocyny (STZ), która selektywnie niszczy trzustkę. komórki (Figura 4A). Szczury, którym podawano STZ, wykazały znacznie obniżony poziom krążącej insuliny i hiperglikemię 5 dni po zakończeniu leczenia (Figura 4B). Przeanalizowaliśmy wpływ tego leczenia na ekspresję genów regulowanych przez insulinę i glukozę. Terapia STZ obniżyła, tak jak oczekiwano, szlaki insulinowe i glukozowe. Ekspresja SREBP-1c, GK, FAS i L-PK zmniejszyła się, jak oceniono za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym i analizy Western blotting (Figura 4, C i D). Ponadto, ilość fosfo-Akt (reszta Ser473) była niższa u szczurów traktowanych STZ niż w grupie kontrolnej (Figura 4D), ponownie odzwierciedlając upośledzenie drogi insuliny. Co ważne, wykazaliśmy, że w tym stanie dwupęka tetraploidalna zawartość hepatocytów (4,1%. 3,7%) była znacznie niższa u szczurów leczonych STZ niż u zwierząt kontrolnych (19,9% <6,6%, Figura 4E). Poprzednio zilustrowaliśmy, że izolując pierwotne hepatocyty podczas rozwoju wątroby po urodzeniu, byliśmy w stanie śledzić ex vivo proces tetraploidyzacji (22). Aby potwierdzić nasze odkrycia in vivo, wykorzystaliśmy tę technikę do sprawdzenia, czy hepatocyty zwierząt leczonych STZ mogły przejść przez cykl komórkowy i dokończyć cytokinezy w celu wytworzenia diploidalnego potomstwa (Figura 4A). W naszych warunkach hodowli, 80% hepatocytów od zwierząt kontrolnych i leczonych STZ przechodziło przez fazę S 48 godzin po wysianiu, z maksymalnym indeksem mitotycznym występującym 60 godzin po wysianiu (dane nie pokazane) [hasła pokrewne: alzheimer pierwsze objawy, linka treningowa dla psa, flucontrol max ] [patrz też: sinulan ulotka, jak oduczyć psa skakania, flucontrol max ]