Droga insuliny / Akt kontroluje specyficzny program podziału komórek, który prowadzi do tworzenia dwujądrowych tetraploidalnych komórek wątroby u gryzoni. ad 8

Całkowite RNA (Macherey-Nagel) wyizolowano z wątroby szczura i zastosowano jako matrycę do syntezy cDNA (synteza cDNA transkryptorowej pierwszej nici, Roche). Ilościową PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu urządzenia LightCycler (Roche Diagnostics) zgodnie z instrukcjami producenta i zestawem green kit SYBR (Roche). Jako startery zastosowano cyklofilinę (sensowny, 5a-ATGGCACTGGTGGCAAGTCC-3 (3, antysensowny, 5a-TTGCCATTCCTGGACCCAAA-3a), FAS (sensowny, 5a-ACCTGTCCCAGGTGTGTGAT-3y, antysensowny, 5a-GCTGTGGATGATGTTGATGA-3 (3), GK (sensowny, 5 (3-CACATCGTAGGACTTCTCCG-3 (3, antysensowny, 5 (3-GGCGGTCTTCATAGTAGCAG-3a), L-PK (sensowny, 5a-GTTGTTTGAGGAGCTACGCC-3 (3 antysensowny, 5 (3-GTCTTCGTCAGCACGATGAT-3.) I SREBP -1c (sensowny, 5 (3 -TTGAAGACATGCTTCAGCTC-3 (3, antysensowny, 5a-GCCTGTGTCTCCTGTCTCA-3a). Wartości podane dla każdego mRNA skorygowano do wartości mRNA cyklofiliny. Western blot. Całkowite ekstrakty białkowe otrzymano z próbek wątroby i pierwotnych hodowli hepatocytów, jak opisano wcześniej (21). Ekstrakty białkowe rozdzielono za pomocą SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany nitrocelulozowe o wielkości porów 0,45 .m. Błony inkubowano przez noc w temperaturze 4 ° C z przeciwciałami przeciwko GK (dar M. Magnusson, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA), FAS (prezent od I. Dugail, Centre de Recherche des Cordeliers, Paryż, Francja), SREBP -1c (NeoMarkers, Interchim Inc.), fosfo-Akt (Ser473) (BD Biosciences), fosfo-p44 / 42 MAPK (Thr202 / Tyr204) (BD Biosciences), białko rybosomalne fosfoS6 (Ser240 / 244) (BD Biosciences ), IR. (C-19, Santa Cruz Biotechnology Inc.) i (32-tubuliny (GTU88; Sigma). Przeciwciała sprzężone z peroksydazą chrzanową (GE Healthcare) zastosowano jako przeciwciała drugorzędowe. Immunoreaktywne prążki wizualizowano za pomocą zestawu chemiluminescencyjnego (Thermo Fisher Scientific). Bloty wystawiono na działanie błon KODAK Biomax, a sygnał IR oznaczono ilościowo, stosując Genesnap wersja 6.00 i oprogramowanie Genetools wersja 3.07 (Syngene). We wszystkich eksperymentach Western blot próbki pobierano na tym samym żelu. Immunohistochemia. Tkanka wątrobowa została utrwalona przez noc w formalinie, zatopiona w parafinie i pocięta na plastry o grubości 5 .m. Pierwotne hepatocyty utrwalano w ~ 20 ° C metanolu przez 3 minuty (w celu wybarwienia a-tubuliny i a-kateniny), w 4 ° C 10% TCA przez 15 minut (w celu wybarwienia RhoA) lub w 4 ° C 4% PFA dla 15 minut (aby zabarwić F-aktynę). Immunohistochemię przeprowadzono z użyciem mysiej anty-kateniny (rozcieńczonej 1: 200, BD Biosciences), mysiej anty-tubuliny (rozcieńczonej 1: 400, Tub 2.1, Sigma-Aldrich), mysiej anty-RhoA (rozcieńczonej 1: 100; Santa Cruz Biotechnology Inc.) i 165 nM Alexa Fluor 488 phalloidin (F-aktyna; Invitrogen). Przeciwciała przeciw mysiej IgG skoniugowane z Alexa Fluor 488 lub Alexa Fluor 594 (rozcieńczone 1: 500, Invitrogen) zastosowano jako przeciwciała drugorzędowe. Hoechst 33342 (0,2 .g / ml, Sigma-Aldrich) włączono do końcowego przemycia w celu barwienia jąder. W przypadku znakowania Ki67 zastosowano monoklonalne przeciwciało przeciw antygenowi proliferacyjnemu Ki67 (rozcieńczony 1: 400; klon KiS5; DAKO). Przeciwciało kozie skoniugowane z polimerem znakowanym nadtlenkiem chrzanu (EnVision; DAKO) zastosowano jako przeciwciało drugorzędowe. Preparaty opracowano za pomocą chromogenu 3-3 (3-diaminobenzydynowego i wybarwiono kontrastowo hematoksyliną Gilla. Pozyskiwanie i analiza obrazu. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu Nikon Statif Eclipse E600 z powiększeniem x 40, celami 1,4. 0,7 NA PL-APO, kamerą CCD chłodzoną DXM1200 (Nikon) i ACT-1 (wersja 2.63, Universal Imaging). W doświadczeniach diploidalnych i tetraploidalnych hepatocytów zobrazowano co najmniej 10 losowo wybranych pól tkanki wątroby (przebadano ponad 2500 komórek). Dla każdego pola uzyskano 2 różne płaszczyzny ogniskowania wybarwienia Hoechst w celu prawidłowego zwizualizowania dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów. W celu barwienia p-tubuliny na skrawkach wątroby i barwienia F-aktyną / RhoA na utrwalonych komórkach, stosy osi z zebrano przy użyciu piezoelektrycznego urządzenia zamontowanego u podstawy powiększenia x63, obiektywu 1,4 NA PL-APO na mikroskopie ZeRA DMRA2 z kamerą Coolsnap HQ sterowaną przez oprogramowanie Metamorph (wersja 7.1, Universal Imaging). W sumie 20. 30 płaszczyzn (plasterki o grubości 0,2. M) zostało przechwycone dla każdej komórki i skompilowane jako pojedyncze dwuwymiarowe projekcje przy użyciu oprogramowania ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Wszystkie obrazy zostały zaimportowane do Photoshopa (wersja CS, Adobe) w celu manipulowania kontrastem i montażu figur. Statystyka. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono co najmniej 3 razy. Wyniki wyrażono jako średnie. SEM. Do analiz statystycznych wykorzystano testy t-próbek Manna-Whitneya i Studenta. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Podziękowania Autorzy dziękują Hél. Ne Gilgenkrantz, Jeanowi Girardowi, Jacques-Emmanuelowi Guidotti, Claudii Mitchell, Mario Pende, Catherine Postic i Nassii Sotiropoulos za krytyczną ocenę tego rękopisu i owocne dyskusje; Catherine Postic, Carina Prip-Buus i Benoit Viollet za narzędzia i porady dotyczące projektowania eksperymentów; oraz Eleanor Luce i Mathilde Bernot za pomoc w eksperymentach Przeciwciało anty-GST szczurze GK było darem od Marka Magnussona. S. Celton-Morizur jest odbiorcą DIM Région Ile de France. Cardio-vasculaire Diab. Te Obésité. i otrzymał stypendium od Agence Nationale pour la Recherche (ANR-05-JCJC-0168-01). Badanie to zostało wsparte dotacjami z INSERM (ANR-05-JCJC-0168-01), la Ligue Comité de Paris (RS09 / 75-70) i Stowarzyszenia pour la Recherche sur le Cancer (ARC-1033). Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Zastosowano niestandardowe skróty: FAS, syntaza kwasów tłuszczowych; GK, glukokinaza; L-PK, kinaza pirogronianu wątrobowego; mTOR, ssaczy cel rapamycyny; mTORC, kompleks sygnalizacyjny mTOR; STZ, streptozotocyna. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.119: 1880. 1887 (2009). doi: 10.1172 / JCI38677
[przypisy: żel do mycia twarzy bioliq, mały weterynarz, usg stawów biodrowych u niemowląt kraków ]
[patrz też: aceklofenak, otifree, mały weterynarz ]