Droga insuliny / Akt kontroluje specyficzny program podziału komórek, który prowadzi do tworzenia dwujądrowych tetraploidalnych komórek wątroby u gryzoni. ad 5

Proliferacyjny stan hepatocytów podczas rozwoju pourodzeniowego (szary, okres ssania, różowy, okres karmienia). Skrawki tkanki zostały wybarwione immunologicznie dla Ki67. Wyniki są średnie. SEM (n = 4 na punkt czasowy). (B) Ekstrakty białkowe wytworzono z tkanek wątroby w dniach 8. 25 i poddano immunoblottingu z przeciwciałami przeciwko IR, GK i fosfo-Akt (Ser473). A-Tubulinę stosowano jako kontrolę obciążenia. Pokazano reprezentatywną analizę Western (n = 5 na grupę) i wykres ekspresji IR. (C) Szczurom z tego samego miotu wstrzykiwano insulinę lub nośnik podczas przejścia od ssania do odsadzenia. Wszystkie szczury odstawiono od piersi w wieku 20 dni, karmiono dietą bogatą w węglowodany i uśmiercono po 24 dniach. (D) Immunoblot z przeciwciałem przeciw fosfo-Akt (Ser473). A-Tubulinę stosowano jako kontrolę obciążenia. Przedstawiono reprezentatywny Western blot (n = 5 na grupę). (E) Procent dwujądrowych komórek tetraploidalnych, obliczony jak opisano na Figurze 2C. Histogramy pokazują. SEM z 3 niezależnych eksperymentów (n = 6). ** P <0,01 względem kontroli pojazdu. AKT w dół od sygnalizacji insuliny reguluje wytwarzanie dwujądrowych tetraploidalnych hepatocytów. Zbadaliśmy, w jaki sposób insulina kontroluje program cytokinezy. W naszym systemie defekt cytokinezy występuje w wyniku braku reorganizacji cytoszkieletu, co prowadzi do dezaktywacji sygnalizacji RhoA (22). Ścieżka PI3K / Akt wydaje się być jedną z głównych ścieżek w dół, które pośredniczą w komórkowym działaniu insuliny. W szczególności intensywne badanie objęło transdukcję sygnału przez ssaczy cel rapamycyny (mTOR) (29, 30). Pokrótce, kompleks sygnalizacyjny mTOR (mTORC1) jest kluczowym regulatorem czynnika wzrostu i sygnalizacji składników odżywczych. Kinaza S6 jest najlepiej scharakteryzowanym efektorem końcowym mTORC1. mTORC2 odgrywa rolę w regulacji cytoszkieletu aktyny i aktywacji Akt poprzez fosforylację Ser473. W związku z tym przetestowaliśmy, czy modulowanie ścieżki PI3K / Akt wpływa na program cytokinezy. Pierwotne hepatocyty izolowano od karmionych szczurów i traktowano specyficznymi inhibitorami szlaku PI3K / Akt. Ze względu na centralną rolę tej ścieżki w przejściu G1 / S, inhibitory farmakologiczne dodano do pożywki hodowlanej po zakończeniu fazy S (48 godzin po wysianiu) i wprowadzeniu mitozy (60 godzin po wysianiu). Najpierw zbadaliśmy wpływ LY294002, selektywnego inhibitora PI3K na hodowane hepatocyty. Zgodnie z oczekiwaniem obróbka LY294002 znacznie zmniejszyła fosforylację rybosomalną Akt i S6 (Figura 7A). Co godne uwagi, to leczenie znacznie zmniejszyło liczbę przypadków niewydolności cytokinezy (46,4%. 17,1% mniej niż u zwierząt traktowanych kontrolą; Figura 7B). Zbadaliśmy, czy zmiana szlaku MAPK, inna główna ścieżka prowadząca do komórkowych efektów insuliny, wpłynęła na program cytokinezy. Stwierdziliśmy, że hepatocyty traktowane inhibitorem MEK U0126 wykazywały taką samą awaryjność cytokinezy jak nietraktowane hepatocyty kontrolne (Figura 7, A i B). W celu dalszej oceny roli szlaku PI3K, przetestowaliśmy działanie konkretnego inhibitora Akt, iAkt VIII, który zapobiega fosforylacji Akt (Figura 7A). To bezpośrednie zahamowanie Akt zmniejszyło częstotliwość niepowodzeń w cytokinezie o 32,4%. 8,2% (rysunek 7B). Zbadaliśmy także organizację cytoszkieletu w leczonych komórkach: komórki traktowane iAkt, które ukończyły cytokinezę, zreorganizowały cytoszkielet aktynowy i zwerbowały RhoA do kory równikowej, w przeciwieństwie do komórek, które nie ukończyły cytokinezy (Figura 7C). Aby zbadać potencjalną rolę mTORC1 i mTORC2, pierwotne hepatocyty traktowano rapamycyną. Jak wcześniej opisano w innych typach komórek (31, 32), rapamycyna specyficznie hamowała mTORC1 (fosforylacja Ser240 / 244 na białku rybosomalnym S6), a nie mTORC2 (fosforylacja Ser473 na Akt, Figura 7D). Zaobserwowaliśmy, że komórki traktowane rapamycyną wykazywały taką samą awaryjność cytokinezy jak komórki nietraktowane (Figura 7E). Wynik ten wskazuje, że mTORC1 nie reguluje wytwarzania komórek tetraploidalnych wątroby. Obecne wyniki ujawniają, że Akt, bezpośrednio lub pośrednio poprzez mTORC2, kontrolował program cytokinezy, aw konsekwencji wytwarzał dwujądrowe tetraploidalne hepatocyty. Figura 7Akt reguluje tetraploidię wątroby. (A i D) Leki LY294002 (LY), iAkt VIII (iAkt), U0126 i rapamycynę (Rapa) lub kontrolę DMSO dodano do pierwotnych hodowli hepatocytów 24-dniowych szczurów 60 godzin po wysianiu. Ekstrakty białkowe przygotowano i poddano analizie Western z przeciwciałami przeciwko fosfo-Akt (Ser473), białkiem rybosomalnym fosfoSi6 (Ser240 / 244; P-S6R) i fosfo-Erk1 / 2 (P-Erk1 / 2). [hasła pokrewne: przychodnia góra kalwaria, koktajl spalający tłuszcz, przerost mięśnia sercowego ] [więcej w: tormed lubliniec, laremid ulotka, disnemar xylo ]